Способ изоэлектрического фокусирования белков Советский патент 1982 года по МПК G01N27/26 

(54) СПОСОБ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ФОКУСИРОВАНИЯ БЕЛКОВ Изобретение относится к электрофорезу в рН градиентах. Известен способ изофокусирования, основанный на том, что в буферном растворе стандартной прописи создается градиен концентрации органического растворителя и при этом также индуцируется градиент рН 1 Наиболее близким к предлагаемому является способ изоэлектрического фокусирования, основанный на том, что градиент рН создается градиентом концентра ции полиолов в боратном буфере. В стеклянной трубке в среде боратного буфера создается градиент концентрации полиола, например маннита, ксилита, или глицерина При этом автоматически образуется градиент рН. Образец белка, растворенный в боратном буфере или диализованный против боратного буфера, вносится в эту же трубку. К ее обоим концам подключают постоянный электрический ток, пол деист- вием которого белок концентрируется в области своей изоэлектрической точки Однако для целей концентрирования белков известный способ не применяется, так как эффект концентрирования незначителен вследствие того, что рН градиент распределен по всей длине трубки. Целью изобретения является повышение степени концентрирования белка при его изофокусировании. Указанная цель достигается тем, что электрофорез белков проводят в ступенчатом градиенте рН, который формируют путем заполнения колонки боратным буфером с рН 8 - 9,1 на 1/8 - 1/10 объема колонки,, добавления ксилита до концентрации 6О - 7О% в боратном буфере и рН 4,0 - 4,2 к заполнения оставшегося объема колонки исходным боратным буфером с пробой белка. Такой способ концентрации белка применим для 85 - 90% всех известных белков, изоточки которых находятся в диапа- 3 976 зоне рН 4,0 - 9,0. Так как процесс изо, фокусирования происходит в очень незначительном объеме растворителя, примерно 0,5 мл, следовательно, и степень концентрирования достаточно высока. Пример 1. Изофокусирование с пелью концентрирования смеси белков, со-стоящей из 0,01% альбумина и 0,01% гемоглобина, проводили на колонке для изофокусирования в борат полиольных cHcтемах. Для этого данные белки растворили до указанной концентрации в О,01 м борно оратном буфере рН 9,0. Затем в колонку наливали 5,0 мл 60% ксилита, растворенного в этом же буфере, после чего его рН снижалась до 4,0 и затем насосом наслаивали 46 раствора белка. Колонку подключали к источнику постоянного тока лри градиенте потенциала 20 в/см. Опыт проводили Б течение 6 ч. Уже через ЗО мин на границе раздела значений рН наблюдали концентрирование гемоглобина. После окончания опыта окра шенная зона была отобрана в объеме О,5 -0,6 мл. На основании спектрофотометрического определения концентрации было показано, что весь внесенный белок сконцентрирован. Пример 2. Концентрирование бел ков мочи. К 5О мл мочи, полученной от больного нефритом, была добавлена бура с целью образования в ней буферн1)го рас вора с рН 9,0 иконцентрацией 0,01 м. После этого 45 мл мочи было наслоено на 5,0 мл раствора ксилита, как в примере 1. фокусирование вели в течение 54. 1 ч при Ю в/см и в течение последуюших 6 ч при 20 в/см. Через 7ч изофо-, кусирования опапесцируюший белок был визуально обнаружен на границе раздела рН. Количественный анализ показал, что концентрация до фокусирования была равна 0,001%, а после фокусирования О,09%. то есть белок был сконцентрирован в. 90 раз. Если для этой цели применить известный способ, то удается повысить концентра1шю белка не более чем в 2 раза, Формула изобретения Способ иэоэлектрическогофокусирования белков, включающий электрофорез белков в градиенте рН в колонке с боратным буфером, отличающий с я тем, что, с целью повышения степени концентрирования белка, электрофорез белков проводят в ступенчатом градиенте рН, который формируют путем заполнения колонки боратным буфером с рН . - 9,1 на 1/8 - 1/10 объема колонки, добавления ксилита до концентрации 60 - 70% в боратном буфере и рН 4,04,2 и заполнения оставшегося объема колонки исходным боратным буфером с пробой белка. Источники информации, принятые во внимание при; экспертизе 1.Авторское свидетельство СССР № 442801, кл. А 61 К 27/10, 1972. 2.Доклады АН СССР 1974, 214, с. 955 - 958.