Способ выделения фактора роста нервной ткани из змеиного яда Советский патент 1983 года по МПК C07K14/71 A61K35/58 C07K1/18 C07K1/30 C07K1/36 C07K14/46 C07K14/48 

Изобретение относится к промышленности биоа тивных веществ и пред ставляет собой способ получения фа тора роста нервной ткани (ФРНТ) из яда гюрзы, усиливающего рост и диф ференцировку симпатических и эмбр нальных сенсорных нервных клеток, введение ФРНТ животному, начиная с перэого дня розвдения, вызывает гипертрофию симпатической нервной си темы, а сенсорные клетки чувствител ны к.ФРНТ только в эмбpиoнaльнo l периоде, ФРНТ используется для и следовательских работ, а также може быть использован в медицине. Известны способы вьи-гпения ФРНТ из тканей животных (слкнная железа мьаии плацента 1 , сердце и др. 2 и биологических жидкостей живот ных, например змеиных ядов, З . Получение ФРНТ из тка.ней кивотных очень трудоемко и не обеспечивает чистоту продукта, так как исто ники препарата представляют собой многокомпонентную смесь различных белковых инебелковых компонентов разделений которых является сложной задачей.. Наиболее эффективным источником фРНТ являются зме.иные яды, готорые содержат только белковые компоненты и имеют стабильный соетав, .ФРНТ обранужен в ядах представ.ителей всех семейств змей 4J . В некоторых ядах определение начальной концентрации ФРНТ невозможно из-за содержания в них высок токсичных компонентов (например в яде кобры. Обычно яды элапидов и. виперидов имеют более сильную активность ФРНТ, чем яды кроталидов. - Состав яда различных змей варьи рует, это связано с видовой специфичностью ядов, а также с местом обитания и условиями существования, в связи с этим получение ФРНТ методами, разработанными на ядах одних змей, не пригодно при работе с ядами других. Способ выделения ФРНТ из ядов среднеазиатских змей не известен. Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ выделения фактора, роста нерв ной ткани из яда песчаной гадюки. (Uipera ammodytes ammodytes), предусматривающий растворение яда в бу ферном растворе - 0,1 М растворе му равьинокислого аммония рН 4,7} с последующим центрифугированием, гельфильтрацию полученной надосадоч ной жидкости на сефадексе Q-50 в присутствий того же буферного.раствора, обессоливание, высушивание и растворение в .0,08 М трис-цитрат ном буфере, рН 7,3 и ионообменную хроматографию на колонке с СЭ-сефадексомС -25 с использованием элюента с повышающейся ионной силой - линейного градиента 0,5М NaCl + 0,5 М трис-цитратного буфера (рН 7,3)., в заключение проводят препаративную изоэлектрическую фокусировку в интервале рН 7-10. Получают препарат ФРНТ с биологической активностью 5-10 мг/мл и выходом 0,-05% 4 о Однако применение разных буферных систем на к;аждом этапе очистки вызывает необходимость трудоемких операций- обессоливания между этапами, применение буферных систем из нелетучих компонентов при лиофилизации вызывает необходимость обессоливанид, применение этапа препаративной изоэлектрическо.й фокусировки требует наличия дорогой импортной аппаратуры и дорогих И1ушортных амфолитов (рН 7-10). Кроме того, недостатком способа является низкий выход препарата (о,05%) . . Цель, изобретения - упрощение способа и повышение выхода препарата ФРНТ. Поставленная цель .достигается тем, что согласно способу вьщеления фактора роста нервной ткани из змеиного яда, предусматривающему растворение яда в буферном растворе с последующим центрифугированием, гельфильтрацию полученной надосадочной хдадкости на сефадексе в присутствии буферного раствора и ионообменную хроматографию с использованием элюен.та с поВЕл ающейся ионной -силой, в качестве исходного используют яд Згюрзы, гель фильтрацию осуществляют на сефадексеG-100, ионообменную хроматографию - на колонке с карбоксиметилцеллюлозой, в качестве буферного раствора в процессе используют 0,19-0,21 М раствор уксуснокислого аммония с рН 6,4-6,6, а в качестве элюента используют указанный раствор в градиенте концентрации от 0,19 0,21 до 0,95 - 1,05 М. Изобретение обеспечивает упроще - ние способа за счет исключения ряда стадий (изоэлектрофокусировки, обессоливания) и проведения процесса в одном буфере. При.этом выход целевого продукта повьЕиается до 30 раз. В качестве буфера.используют раствор уксуснокислого аммония с молярностью 0,19-0,21 М, рН 6,4-6,6 и удельной электропроводностью (14,5 15f5) . 10 рС«1-,а в качестве элюента используют линейный градиент из растворов уксуснокислого аммония 0,19-0,21 и 0,95-1,05 М с удельными электропроводностями растворов (14,4 - 15,5). 10- (63-65). 10р-CIV (рН 6,5-6,6), соответственно. Аммоний уксуснокислый является очень гигроскопическим веществом и с целью приготовления хорошо воспроизводимых буферных растворов необходим контроль ионной силы раст вора, а самым удобным методом явля ется кондуктометрический метод. Уде ная электропроводность расчитывается по формуле V3 pip.c«), где К - константа ячейки кондукто метра, ; Р - сопротивление раствора,Ом Использование уксуснокислого аммония в качестве буфера на стадии растворения яда обеспечивает создание среды для последующего разделения. Гельфильтрации подвергают рас вор яда гюрзы, разделение происходи на геле, причем в качестве геля ис пользуется сверхтонкий еефадекс Сз-100, разделяющий белки в пределах молекулярного веса 4000-150000 дальтон. Яд гюрзы, содержащий-мнопокомпонентную смесь, разделяется на 9 белковых пиков. 1-1 И и V-1X. пикнув которых присутствуют протеазы, нуклеазы, оС -аминооксидаза, и другие вещества, исключаются. Степень очистки - 5-6 раз. Последующей ионообменной хроматографии подвергают фракции 1V пика Гельфильтрации. В качестве ионита используют избирательно действующую карбоксиметилцеллюлозу и Проводят селективное разделение. На конит наносят раствор ФРНТ с удельной электропроводностью (14,5 15,5). |} см- (рН 6,4-6,6). При этом основная часть белка проходит ионообменник, а ФРНТ связывается на катионит, который элюируют линейным градиентом ионной силы. Таким образом, предлагаемый способ заключается в следукадем: яд гюрзы растворяют в растворе уксуснокислого аммония (0,19-0,21 м) с удельной электропроводностью (14,5 15,5). см-(рН 6,4-6,6), центрафугируют, осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для Гельфильтрации, гельфильтрацию проводят на йверхтонком сефадексе Q-.100 с раствором 0,19-0,21 М уксуснокислого аммония с удельной эле тропроводностью .(14,5-15,5) - . см (рН 6,4-6,6), Полученная фракция ФРНТ с приблизительно одинаковым молекулярным весом наносят непосред ственно на колонку карбоксиметилцеллюлозы. Основная часть белка про ходит катионит, а ФРНТ связвсвается на карбоксиметилцеллкшозу при рН 6,4-6,6 и удельной электропровод- ности раствора (l4,5 - 15,5}-Чдр.см; элюируют Линейным градиентом ионной силой раствора уксуснокислого аммония (0,19-0,21)-(0,95-1,05 М) с удельной электропроводностью (14,5 15,5 105- (бЗ-65;« 10-Ъ.см-(рН 6,4 6,б). Фракции ФРНТ собирают и высуимвалот при помощи лиофилизации. Выход 1,5% биологическая активность 5 10 мг/мл. П р им е р- 1. К 4,9 г яда гюр-. зы добавляют 35 мл 0,19 М раствора уксуснокислого аммония с. удельной электропроводностью 14, р.см (рП 6,4)/ сялесь медленно перемешивают в течение 4 ч при , Растворанный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 4°С в течение 30 мин Осадок йыбрасывают,надосадочную жидкость используют для гельфильтрации. На уравновешенную раствором уксуснокисуюго аммония (.удельная электропроводность 14,5-10р.см колрнку со- сверхтонким сефадексом Q-100 fразмер колонки 4,2 140 см) наносят раствор яда. Колонку элюируют раствором уксуснокислого сшмо.ния с удельной электропроводностью 14, 5 10()(рН 6,4) со скоростью «13 мл/ч и собирают фракций по 19 мл.. Оптическую-плотность элюата р.егистрируют непрерывно с помощью Увикорда-11. Получают 9 белковых пиков. В IV пике фракции, которые имеют биологическую активность ФРНТ, объединяют (объем 193 мл). Раствор ФРНТ наносят на уравновешенную раствором 0,19 М уксуснокислого аммония удельной электропроводности 14/5-10 р.см(рН 6,4) колонку карбоксиметилцеллюлозы КМ-.52. Через колонку пропускают 0,5 л 0,19 М раствора уксуснокислого агфюния удельной электро-;проводности 14,510 р. см (рН 6,4) , Скорость элюции 45 мл/ч, собираютс я, фракции по 15 мл. Оптическую пЗютность элюата регистрируют непрерывно с помощью Увикорда, Основная часть белка проходит катионит в даншлх условиях, а ФРНТ, изоэлектрическую точку выше 8,5, связывается на катионит КМ-52 и его элюируют линейным градиентом ионной силы уксуснокислого аммония от (0,19 м) удельной электропроводности 14,5р.см (500 мл) до . . 0,95 м) . 63.(500 мп) (рИ 6,4) . Фракции, содержащие биологическую активность ФРНТ, объединяют (выход 605 ш) и высушивают лиофильно, Характеристика препарата: Выход, мг 76,56 мг (1,56% по белку). Выход по активности, % 98,0 Биологическая активность, 5Ю мг/мл Степень очистки, раз 64,0 Пример 2. К5,0г яда гюрзы добавляют 35 .мл 0,2 М раствора уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 15,0.10.. рН 6,5). Смесь медленно перемеиив.ают в течение 4 ч. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин при 4С. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гельфильтрации. На уравновешенную 0,2 М раствором уксуснокислого аммония (удельная электропроводность 15,0-Ю р- см колонку со сверхтонким сефадексом Q-100 с размером колонки 4,2140 см наносят раствор яда. Колонку элюируют раствором уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 15,0 , см(рН 6 ,5) со скоростью 13мл/ч и собирают фракции по 19 мл. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью Увикорба-li. Получают 9 белковых пиков, В IV пике фра;кции, которые имеют биологическую активность ФРНТ, объединяют (сЬбъем 190 мл) .

Раствор ФРНТ наносят на уравновешенную раствором уксуснокислого аммония с удельной электропровод- , ностью 15,.(рН 6,5 колонку КМ-52. Через колонку пропускают 0,5 л раствора уксуснокислого аммония (рН 6,51 с удельной электро- ; проводностью 15,0 КТ. Скорость элюции 45 мл/ч, собираются фракции по 15 МП. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью Увикорда. Белки, связывающиеся -на КМ-52 в данных условиях, элюируют линейным градиентом ионной силы 0,2-1,0 М уксуснокислого аммония от удельной электропроводности раствора .15,0 .СМ- (500 мл) до 64,0 10;р. см (500 мл) при рН 6,5. Фракции, содержащие биологическую активность ФРНТ, объединяют (выход 588 мл)и высушивают лиофильно.

Характеристика препарата: Выход,мл 77,52 (1,55% по

белку).

Выход по активности, % 98,2 Биологическая

активности, мг/мл 510 Степень очистки, раз 64,5

Пример 3. К 5,1 г яда гюрзы добавляют36 мл 0,21 М раствора уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 15,5 . см рН 6,6), смесь медленно перемешивают в течение 4 ч. Растворенный

яд центрифугируют при ЬООО об/мин в течение 30 мин, при 4 С. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гельфильтрации. На уравновехяенную. 0,21 М раствором уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 15,5 см колонку со сверхтонким сефадексом G-100 с размером колонки4, с наносят раствор яда. Колонку элюируют 0,21 М раствором уксуснокислог аммония с удельной электропроводностью 15,5Ю р-см(рН 6,6) со скоростью 13 МП/ч и собирают фракции по 19 мл;. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью Увикорда-И. Получают 9 белковых пиков. В IV пике фракции, которые имеют биологическую активность ФРНТ, объединяют (объем 196 м

Раствор ФРНТ наносят на уравновешенную 0,21 М раствором уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 15,510/5-см(рН 6,6} колонку КМ-52. Через колонку пропускают 0,5 л 0,21 М раствора уксуснокислого аммония (рН 6,б1 с удельной электропроводностью 15,)-с Скорость элюации 45 мл/ч, собирают фракции по 15 мл. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью Увикорда. Белки, связывающиеся Па КМ-52 в данных условиях, элюируют линейным градиентом ионной силы уксуснокислого аммония (1,05 М) от удельной электропроводности раствора 15 ,5 10V-cav|(500 мл) до 65, 0-10 р-с м 550 мл при рН 6,6. Фракции, содержащие биологическую активность ФРНТ, объединяют (выход 593 ) и высушивают лиофиль но. ФУНТ элюируется в данных условиях в первом пике градиента и разделяется от протеолитического фермента, имеющего более высокую рН, чем ФРНТ.

Характеристика препарата: Выход, мг 79,9 (1,57% по

белку)

Выход по активности, % 98,0 Биологическая активность, мг/мп. 6-10 Степень очистки, раз 63,8 Лиофилизованный препарат ФРНТ полностью сохраняет биологическую активность в течение 24 мес. при хранении при 4.

Определение биологической активности ФРНТ выполняют, по йзвестной методике Д .

Биологическую активность ФРНТ определяют с помощью культуры сенсорных ганглиев 8-дневного куриного эмбриона, наблюдая радиаль Ный рост аксонов от ганглия.

Сенсорные ганглии куриного эмбриона помещают в 3 мл раствора, состоящего из 10% сыворотки крови в культуральной среде W 199, 300 единиц пенициллина и стрептомицина и 0,01-0,05 мл исследуемой пробы, растворенной в этом же растворе. Пробу инкубируют в течение 18-24 ч при . При наличии в растворе ФРНТ можно наблюдать радиальный рост аксонов от ганглия. В зависимости от плотности и щирины образовавшегося венца положительный ответ на

присутствие ФРНТ оценивают по 5-бальной шкале.

За биологическую активность ФРНТ принимают ту минимальную концентрацию препарата в культуральной среде, которая вызывает +3 - ответ сенсорных ганглиев за 18 ч инкубации по 5-бальной шкале.

Технико-экономический эффект изобретения заключается в экономии змеиного яда за счет увеличения выхода препарата фРНТ. При этом упрощается процесс очистки ФРНГ из яда гюрзы.

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ФАКТОРА РОСТА НЕРВНОЙ ТКАНИ ИЗ ЗМЕИНОГО ЯДА, предусматривающий растворение яда в буферном растворе с последующим центрифугированием гельфильтра; цию полученной «адосадочной жидкости на сефадексе в присутствии буферного раствора и ионообменную хроматографию с использование элюента с повышающейся ионной силой, о т л и - . чаю щ и и с я тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода целевого продукта, в качестве исходного используют яд гюрзы, гельфильтрацию осуществляют на сефадексе G-100, ионообменную хроматографию - , на колонке с карбоксиметилцеллюлрзой, в качестве буферного раствора в процессе используют 0,19-0,21 М раствор уксуснокислого аммония с рН 6,4-6,6, а в качестве элюента используют указанный радтвор в градиенте кон центрации от 0,19-0,21 до 0,95 1,05 м;