Способ определения изофермента лактатдегидрогеназы-1 в сыворотке крови Советский патент 1988 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к иммунологии и медицинской биохимии.

Целью изобретения является создание высокос11еци })ическо о и iipocroio в техническом исполнении способа оиреде.мения изофермента лактатдегидрогеназ (ЛДГ)-1 в сыворотке крови.

Способ осуществляется следующим образом.

Предлагаемый способ определения и сыво ротке крови человека изофермента ЛДГ-1 основан на исиользовании |-етерологических антител, нолученн1 1х к сос/гветствующему изоферменту ЛДГ свиньи. Способ заключается в уда;1ении с помощью антител к М-субъединицам четь1рех изоформ ЛДГ, содержащих ьединицы, и измерении активности осгавшегоея в тестируемой сыворотке изофермента ЛДГ-1, который не ео- держит н свое.м составе Л -суб1 единин.

( целью :)ффск111ВН01Ч1 удаления об|)азу|)- н.1.егося иммунного комнлекса ангител, полученных к соответствующему изофе)менту ЛДГ свиньи, с содержащими М-субьединицы изофор.мами Л/1Г антитела предварительно связывают с нерасгворимым носителем. В качеспве твердофазной основы используют убитые клетки Stapylococcus anreus, содержащие в составе своей бактериальной стенки белок Л. Источником антител для получения стафи. Юкоккового иммуносорбен- та служит гетеро.югическая ангисыворотка кролика, полученная в резу. 1ьтате иммунизации животного изоферментом ЛДГ -5 свиньи, содержащим только М-субъединицы.

Способ вк.1ючает чегыре стадии; определение оби1ей ферментативной ак1ивности ЛДГ в тестируемой пробе; обработка пробы стафилококковы.м иммуносорбенгом с целью связывания четырех изоферментов; ЛДГ-2, ЛДГ-3, ЛДГ-4 и ЛДГ-5; удаление стафилококкового и.ммупосорбента со связанными изоформами /1ДГ центрифугированием; определение осгаточной ферментативной активности ЛДГ, соответствующей активности изофермента ЛДГ-1.

Первая и четвертая стадии анализа проводятся с иснользованием общепринятых методик определения ферментативной активности ЛДГ.

Предлагаемый способ характеризуется высокой специфичностью, поско;1ьку имеет место количественное отде;1ение определяемого изофермента ЛДГ-1 от четырех остальных. Полнота разделения изоформ ЛДГ подтверждается данными электрофореза в ага- розе образцов сыворотки, взятых до и после обработоки ее стафилококковым иммуно- сорбентом.

Пример I. Определение изофермента ЛДГ-1 в сыворотке крови человека.

А. ()пределе1П1е общей ферментативной активности ЛДГ в тестируемой сыворотке.

Общую активность ЛДГ в тестируемых

0

0

5

0

5

0

5

пробах определяли с помощью известного колориметрического метода. Образующийся в результате ферментативной реакции окисления лактата в пируват НАД.Н через промежуточный переносчик электронов фе- назинметосульфат восстанавливал соль тет- разолия в окрашенный формазан, который определяли фотометрически. Величину оптической плотности растворов измеряли на колориметре ФЭК - 56 М при длине волны 490 пм. Расчет активности ЛДГ в донорской cbiB(j)OTKe проводили по формуле: (бп1ая активность

- A I Q где .Л| оптическая плотность пробы, содержащей тестируемую сыворотку;

.A.i оптическая плотность слепого опыта к пробе, содержащей сыворотку;

A.t оптическая плотность пробы, в которую вместо сыворотки добавлен эталонный раствор;

АГ, оптическая плотность слепого опыта (к пробе, содержап1ей эталонный раствор);

Q активность Л/1Г в эталонном растворе (200 Е/л).

Б. Обработка пробы стафилококковым иммуносорбентом, содержащим аптитела к М - с у б ьед и н и ца м , 1Д Г.

В пробирки с набухшим в фосфатно-со- легзом буфере стафилококковым иммуносор- бетом, взятым из расчета 70 мг сухого веса бактериальных клеток на одну пробирку, добавляли 80 мкл тестируемой сыворотки. Соотнощение объем сыворотки (мкл) - сухой вес стафилококкового иммуносорбента (мг) равно 1,14:1. Пробы тщательно перемешивали и инкубировали 5 мин при комнатной температуре.

Стафилококковый иммуносорбент представляет собой убитые клетки Sraphylococcus anreus, содержащие в составе своей бактериальной стенки белок А с сорбированными на этом белке моноспецифическими иммуноглобулинами G к М-субъединицам ЛДГ. Моноспецифические антитела получены в результате иммунизаци кроликов гомогенным препаратом ЛДГ -5 свиньи и последующей очистки антисыворотки.

В. Удаление стафилококкового иммуносорбента со связанными изоферментами ЛДГ,

Разделение оставшегося в растворе изо- фермепта ЛДГ-1, не содержащего М-субъединицы, и связавшихся со стафилококковым иммуносорбентом изоформ ЛДГ, содержащих в своем составе от одной до четырех М-субъединиц (ЛДГ -2, ЛДГ-3, ЛДГ--4, ЛДГ-5), проводили центрифугированием проб на центрифуге ЦУМ-1 со скоростью 6000 об/мин при комнатной температуре в течение 10 мин.

Г. Определение остаточной ферментативной активности ЛДГ.

Полноту отделения изоформы ЛДГ-1 от четырех остальных контролировали элект- рофоретически.

Остаточную ферментативную активность ЛДГ в супернатанте после центрифугирования тестируемых проб, соответствующую активности изофермента ЛДГ-1, определяли так же, как и общую ЛДГ-активность (см. пример 1А). Используя полученные результаты измерения общей и остаточной ферментативной активности, рассчитывали активность и относительное содержание изофермента ЛДГ-1. используя формулу:

активность ЛДГ-1 (Е/л ),

А -AS

где А2 - оптическая плотность пробы, содержащей обработанную стафилококковым иммуносорбентом тестируемую сыворотку;

АЗ, AI, AS, Q - имеют указанные выше значения.

Полученные значения ферментативной активности и относительного содержания ЛДГ-1 в сыворотке крови человека согласуются с известными соответствующими величинами в норме.

Пример 2. Аналогичен примеру 1, за исключением того, что соотношение объем сыворотки (мкл) - сухой вес стафилококкового иммуносорбента (мг) равно 2:1.

При увеличении доли добавляемой к стафилококковому иммуносорбенту тестируемой сыворотки (отношение объема сыворотки к сухому весу стафилококкового иммуносорбента больше 2) наблюдается неполное связывание со стафилококковым иммуносорбентом и удаление из тестируемой сыворотки прежде всего изофермента ЛДГ-2, а также других изоформ, содержащих М-субъеди- ницы.

Пример 3. Аналогичен примеру 1, за исключением того, что соотношение объем сыворотки (мкл) - сухой вес стафилококкового иммуносорбента (мг) составляло 1:1.

Уменьшение отнощения объема сыворотки (мкл) к сухому весу стафилококкового иммуносорбента (мг) .меньще 1 приводит к понижению точности определения вследствие разбавления пробы остаточным количеством влаги, содержащейся в набухшей массе стафилококкового иммуносорбента.

0

0

5

0

В сравнении с прототипом nptvi.i.ii ас- мый способ определения и.1о4 С|:мс11 ЛДГ-1 в сыворотке к)ови упроиикм пи ределение ЛДГ благодаря применении) lo.ii,- ко одного типа антител для разделения IMO- форм ЛДГ, использованию допустимо о -l ( мента (ЛДГ свиньи) в качестве агспги д.|н получения антител. Применение rert pc.ioiи ческой антисыворотки позво;1яет и-и к ж;пь трудностей этического и практического H.KJ- на, возпикаюн1их при работе с трупным материалом как источником антигенов л.ы получения гомогологической антисыв1))итк1 В отличие от ковалентной сшивки антитсм с полимерной матрицей испо. 1ьзонанис направленного специфического нековалентною связывания антител своим константн1 1м участком с белком А клеток стафилококка увеличивает число участков антии л, пиь имодействующих с антигеном, с сохранением эффективности отделения связанных и не связанных с антителами изоферментои ЛДГ Кроме того, уменьшается число операций при проведении анализа; уменьншется более чем в 2 раза количество сыворогки, требуемой для тестирования.

Предлагаемый способ определения изофермента ЛДГ- 1 в сыворотке крови открывает возможность создания набора для диа|-- ностики инфаркта-миокарда.

Формула изобретения

Способ определения изофермента лактат- дегидрогеназы-1 в сыворотке крови, вк.1К)- чающий измерение общей активности лактат- дегидрогеназы в исследуемой пробе, удаление изоферментов лактатдегидрогеназы путем добавления моноспецнфических антипел к М-субъединицам лактатдегидрО1еназы с последующим центрифугированием и онределе- нием остаточной ферментативной активности, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, удаление нзоферментов лактатдегидрогеназы осуществляют моноспецн- фическими антителами к М-суб ьеднннцам лактатдегидрогеназы свиньи, сорби)(-М1ан11ы- .ми на убитых клетках St.aureus, си.и-ржа- Щих белок А, при :)том добавляю их к lu i u- дуемой пробе в соотношении 1:1 :..

Изобретение относится к иммунологии и медицинской оио.химии. Ц(.мь изобретения - создании иысокоспецифичного и простого в техническом исноочнении способа определения изофермеита лактатдеги.ч- рогепазы (ЛДГ) 1 к сыворотке крови. Д.чя этого используют гетерологические антитела, полученные к соответствующему изофермен- ту ЛДГ свиньи. Удаляют с помощью ан- гител к М-субъединицам 4 изоформы ЛДГ, содержащие М-субъединицы, и измеряют активность оставшегося в тестируемой сыворотке изофермента ЛДГ-1, который не содержит в своем составе М-субъединиц. Способ включает 4 стадии: определение общей ферментативной активности ЛДГ в тестируемой пробе; обработка пробы стафилококковым иммуносорбентом с целью связывания 4 изоферментов: ЛДГ-2; ЛДГ-3; ЛДГ-4 и ЛДГ-5; удаление стафилококкового имму- носорбента со связанными формами ЛДГ центрифугированием; определение остаточной ферментативной активности ЛДГ, соответствующей активности изофермента ЛДГ-1 Полнота разделения изоформ ЛДГ подтверждается данными электрофореза в агарозе образцов сыворотки, взятых до и после обработки ее стафилококковым иммуносорбентом. о (Л со со С71