Способ количественного определения дезоксирабонуклеиновых кислот в биологических жидкостях Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к исследованию биологических материалов с использованием радиоактивных меченых веществ, а именно к количественному определению ДНК, и может быть использовано в экспериментальных и лабораторно-клинических исследованиях для диагностики патологических состояний, сопровождающихся появлением ДНК в биологических жидкостях.

Известны способы определения ДНК в биологических жидкостях, основанные на преципитации исследуемой ДНК антителами к катив ной ДНК i .

Однако этот способ обладает низкой чувствительностью и недостаточной специфичностью.

Известен также способ количественного определения ДНК в биологических жидкостях путем обработки исследуемого образца раствором , меченой радиоизотопом 1, и сы- i вороткой крови, содержащей антитела к нативной ДНК, с последующей инкубацией при в течение 1 ч и при в течение ночи, осаждением иммунных комплексов насыщенным раствором сульфата аммония при 4°С в течение 1 ч, определением радиоактивности в осадке и расчета коли,чества ДНК по калибровочной крови 2 .

Однако известный способ является сложным и длительным при выполнении а также недостаточно чувствительным .Сложность обусловлена предварительным отбором сыровороток и использованием больших количеств меченого препарата j дезоксиуридина с высокой удельной активностью. Чувствительность снижается вследствие диссоциации иммунных комплексов в полунасыщенном растворе «сульфата аммония. Время определения составляет 18 ч.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа.

Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа требуется обработка исследуемого образца раствором ДНК, меченвлм радиоизотопом, и сывороткой крови, содержащей антитела к нативной ДНК, с последующей инкубацией, осаждением иммунного комплекса и определением ДНК, перед инкубацией в реакционную смесь добавляют декстрансульфат в концентрации 13-16% и инкубацию осуществляют в течение 30-40 мин, а иммунные комплексы осаждают 3,5-5,0%-ным раствором полиэтиленгЛиколя в течение 1,5 2 ч.

Способ осуществляется cлeдs oщим образок.

Готовят реакционную смесь, состоящую из 20 мкл тестируемого образца, меченой радиоизотопом трития ДНК с массой, цоответствующей 2000 имп./мин в объеме 30 мкл и 1 мкл сыворотки больного системной красной волчанкой, содержащей антитела к нативной ДНК. Осаждают белки, неспецифически реагирующие с ДНК, добавлением 20-25 мкг декстрансульфата в 20 мкл и общий объем смеси доводят до 150 мкл стандартным солевым раствором (0,15 М NaCI 0,015 М цитрат натрия, 0,003 М трисНСЕ) , рН 8,0.Смесь инкубируют 30 40 мин при З7с. Иммунные комплексы осаждают в 3,5-5%-ном растворе полиэтиленгликоля при 4°С в течение 1,5-2 ч..Полученный раствор центрифугируют в течение 30 мин при 3000 обi/мин и определяют радиоактивность надосадочной жидкости. Количество ДНК определ5пот по калибровочной кривой, построенной аналогичным способом с известными количествами ДНК.

Пример. Проводят определение концентрации ДНК в сыворотках больных вирусным гепатитом. К 1 мкл сыворотки больного системной красной волчанкой, содержащей антитела к нативной ДНК, добавляют 20 мкл тестируемой сыворотки, 20 мкг декстрансульфата в 20 мкл стандартного солевого раствора, 30 мкл меченой радиоизотопом Н ДНК 2000 имп/мин. (удельная активность 5-10 имп/мин) в этом же растворе. Общий объем реакционной смеси доводят до 150 мкл стандартным солевым раствором (0,015 М цитрат натрия; 0,15 М хлорид натрия) с добавлением трис-НС буфера до конечной концентрации 0,003 М (рН 8,0). Смесь инкубируют 30 мин при , добавляют равный объем 10%-но|Го полиэтилеигликоля в том же буфере, полученную смесь перемешивают и оставляют при в течение 2ч. Затем полученный раствор центрифугиР5ют в течение 30 мин при 3000 об/ми ,я определяют радиоактивность навосадочной жидкости в 150 мкл смеси, нанесенной на бумажный фильтр.

Количество ДНК в пробе определяют по калибровочной кривой, построенной следующим образом: готовят реакционную смесь, состоящую мкл сыворотки, содержащей антитела к нативной ДНК, 30 мкл н ДНК,20 мкг декстрансульфата, 20 мкл разведенной сыворотки человека 1;100 и различные количества нативной ДНК от 0,01 нг до 300 иг. Общий объем доводят до 150 мкл стандартным солевым раствором с добавлением трис-НС буфера до конечной концентрации 0,003 М (рн 8.0). Смесь инкубируют 30 мин при 37°С, добявляют равный Объем 10%-иого полиэтиленгликоля, перемешивают и оставляют при 4 С в

течение 2 ч. Осадок отделяют центрифугированием и определяют радиоактивность надосадочной жидкости. Используя получ енные значения радиоактивности свободной ДНК, строят кривую зависимости процента связанной меченной радиоизотопом н ДНК от количества тестируемой ДНК, внесенной в реакционную смесь (см.чертеж|.

С повьаиением концентрации определяемой ДНК, отношение между свобоным и связанным лигандом уменьшается. Минимальная определяемая концентрация ДНК 0,03 нг в пробе или 1,5 нг/мл, максимальная 2 нг в пробе или 250 нг/мл. Точка , полученная путем экстраполяции данных отношения свободного и связанного лиганда для определяемой концентрации ДНК в сыворотке больного вирусным гепатитом соответствует 160 нг/мл сыворотки.Эффективность определения ДНК в присутствии декстрансульфата, определялась путем сопоставления калибровочных кривых/ построенных аналогичньам образом с добавлением декстрансульфата и без него.

Чувствительность метода {Определения ДНК вприсутствии декстрансульфата (кривая 1:) 1,5 нг/мл, а без декстрансульфата (кривая 2) 50 нг/мл.

Таким образом, способ обеспечивает по сравнению с существующими упрощение метода за счет устранения предварительного отбора сыворотки, содержащей антитела к нативной ДНК; повышение чувствительности с 25 30 нг до 1,5-3 нг в пробе и сокращение времени определения с 18 ч до 3 ч.

Устранение неспецифически реагирующих с ДНК белков при одновременном использовании нового осадителя дает возможность использовать более широкий спектр антител. В результате удаления белков, неспецифически реагирующих с ДНК и конкурирующих с антителами за участки связывания, повышается чувствительность определения концентрации ДНК в биологических жидкостях.

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО СП РЕДЕЛЕНИЯ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВЬК 0 w«e«tye, между .Сбободноа / .tin.otf : УНЛНК 4. Дв AS 2.0 /,2 0. КИСЛОТ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ путем обработки исследуемого образца раствором ДНК, меченой радиоизотопом, и сыровороткой крови, содержащей антитела к ДНК, с последующей инкубацией, осаждением йкч«1унного комплекса и определением ДНК, отличающийся тем, ITO, с целью Повышения чувствительности способа, перед инкубацией в реакционную смесь добавляют декстрансульфат в концентрации 13-16% и инкубацию осуществляют в течение 30 40 мин, а иммунные комплексы осаждают 3,5-5%-ным раствором полиэтиленгликоля в течение 1,5-2 ч. -х. ,