Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L.-продуцент моноклонального антитела, реагирующего с @ -субъединицей ХГЧ, ЛГЧ, ТТГЧ и ЛГ и ХГ лощади Советский патент 1992 года по МПК C12P21/08 

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и может быть использовано для разработки иммунологических способов определения уровня хориониче- ского гонадотропина человека (ХГЧ), лютеинизирующего гормона человека (ЛГЧ), фол- ликулостимулирующего гормона человека (ФСГЧ) и тиреотропного гормона человека (ТТГЧ) в биологических жидкостях организма с помощью продуцируемых штаммом моноклональных антител (МкАт) с целью диагностики беременности у женщин на ранних сроках, мониторинга за состоянием. беременных в группах риска, диагностики хори- онэпителиомы и с целью диагностики патологии процесса репродукции и гипофункции щитовидной железы у новорожденных.

Известны моноклональные антитела к ХГЧ, некоторые из которых, направленные против Р -субъединицы ХГЧ (/3-ХГЧ), перекрестно реагируют с ЛГ человека, другие специфичны для /9 -ХГЧ, моноклинальные антитела, направленные против а -субъеди- ницыХГЧ (а -ХГЧ), перекрестно реагируют с ЛГЧ.

Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши, продуцирующего моноклональные антитела, специфичные к а -ХГЧ, а -ЛГ.а -ФСГЧ, а-ТТГЧ.

Штамм получают следующим образом.

В качестве антигена используют офици- нальный препарат хорионического гонадот- ропина человека (ХГЧ). выпускаемый Московским эндокринным заводом.

Мышей линии BALB/C иммунизируют внутрибрюшинно по следующей схеме: в 1-й день - 500.ед. препарата в смеси с полным адъювантом фрейнда (ПАФ), на 14-й и 28-й дни по-2.50 ед. препарата с ПАФ, реим- мунизация на 56-й день - 2500 ед. препарата ХГЧ в забуференном физиологическом растворе хлорида натрия. ; Через 72-96 ч после реиммунизации у мыши стерильно удаляют селезенку и готовят суспензию спленоцитдв. Клетки селезенки сливают (гибридизуют ) с клетками мышиной миеломы X 63 А 8.653. Сливающий агент - ПЭТ-1500 (50%-ный раствор). Селекцию проводят на среде HAT, два клонирования методом лимитирующего разведения (1 клетка на 3 лунки), 100% позитивных клонов.

.Стандартные условия выращивания: среда. RPMI1640 с 10% фетальной сыворот- ки крупного рогатого скота (FCS), температура при культивировании 37ЬС, газовая фаза - воздух с 5% СОа/

Способ культивирования в пластиковых флаконах на 50-250 мл, посевная доза 500000 клеток/мл, кратность рассева 1:2, время субкультивирования 3-4 дня.

- В организме животного - мышь BALB/C. обработанная пристанем (1,0 мл в/брюшинно за 5-10 дней до инокуляции), доза инокуляции 3-8 млн клеток, время образования асцита 10-20 дней.

Полученный штамм гибридных клеток обозначен Ф 15. Штамм хранят в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной

коллекции клеточных культур под номером ВСКК (П) 398 Д.

Данные видовой принадлежности: мышиные клетки линии BALB/C. Гибридома секретирует моноклональные антитела против а -субъединицы ХГЧ, ЛГ, ФСГ и ТТГ человека, определяемые иммуноблотингом и иммуноферментным методом. Контаминации бактериями и грибами нет, микоплазмы не выявлены.

Штамм гибридных клеток продуцирует моноклональные антитела IgG класса, направленные против а -ХГЧ, а -ЛГ,а -ФСГ и .а-ТТГ человека. Концентрация полезного продукта (моноклональных антител против

а-ХГЧ, а -ЛГ.а -ФСГ и а -ТТГ человека) в культуральной среде около 10 мкг/мл, в асцитической жидкости около 5 мг/мл, титры данных антител при определении с помощью твердофазного иммуноферментного

метода 1:3000 в культуральной среде, 2x105 в асцитической жидкости, при концентрации антигена при нанесении на пластинки 30 ед./мл препарата гормона.

Определение данных антител можно

также проводить иммунофлуоресцентными и радиоиммунологическимй методами. Продукция моноклональных антител стабильна по крайней мере в течение 25 пассажей ин витро и 15 пассажей на животных.

Способ криоконсервации: 4x106 клеток в RPMI с 10% FCS и 10% DMSO, замораживание в пенопластовой коробке при -70°С, жизнеспособность клеток после размораживания 70-90% (оценка жизнеспособности по включению клетками трипанового синего после 24 ч культивирования).

Использование штамма гибридных клеток № ВСКК (П) 398 Д.

При использовании гибридомы получены специфические к а -ХГЧ, а -Л Г, а -ФСГ и а -ТТГ человека моноклональные антитела путем выделения их из асцитической жидкости мыши. Из 1 мл асцитической жидкости 6 помощью высаливания сульфатом

аммония с последующей ионообменной хроматографией на колонках с ДЕАЕ-52 целлюлозой выделено 5 кг моноклональных антител анти а-ХГЧ,а -ЛГ.а -ФСГ и а - ТТГ человека

Контроль на специфичность монокл о- нальных антител проведен в системе твердофазного иммуноферментного анализа. Моноклональные антитела реагируют с а - ХГЧ, цельной молекулой ХГЧ, ЛГ. ФСГ и ТТГ

человека, Л Г и ХГ лошади. МкАТ не реагируют с ЛГ и ФСГ коровы и свиньи., Пример. Продуцируемые штаммом МонАт используют для разработки твердофазной системы иммуноферментного анализа для определения ХГЧ и ЛГЧ в биологических жидкостях организма. На пластинках для иммунологических исследований отечественного производства адсорбируют МонАт против а -ХГЧ (10 мкг/мп), инкубируют при 4°С в течение 12- 17 ч. Несвязавшиеся с пластиком Ат отмывают 3 раза ФБР, открытые места пластика забивают добавлением 1 %-ного раствора БСА в ФБР. Инкубируют пластинки при комнатной температуре в течение 1 ч. отмывают 3 раза ФБР с Т.вином-20 (0,5 мл на 1 л - 0,05%). Добавляют исследуемую пробу биологической жидкости. .Инкубируют 1 ч при 37 С, отмывают3 раза ФБР-Твин-20, добав0

ляют коньюгированные с пероксидазой МонАт Ф15-ВСКК (П) 398 Д (концентрация 4 мг/мл) в рабочем разведении 1:1600 в ФБР- Твин-20. Инкубируют. 1ч при37°С, отмывают 5 раз ФБР-Твин-20 и 3 раза холодной водопроводной водой, добавляют субстрат и хромоген (4 мг ОФД на 10 мл цитратного буфера рН 5,0 и 4 мкл 33%-ной перекиси водорода) на 20 мин при комнатной темпе-. ратуре. Останавливают реакцию добавлением раствора серной кислоты (2 М) и учитывают результат путем измерения оптической плотности при 492 им.

Формул а изобретени я Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus Musculus L. ВСКК(П) 398Д - продуцент моноклонального антитела, реагирующего с/-субъединицей ХГЧ, ЛГЧ, ФСГЧ, ТТГЧ. Л Г и ХГ лошади.

Изобретение относится к медицине и биотехнологии. Использование продуцируемых штаммом N; ВСКК (П) 398 Д монокло- нальных антител (МкАт) позволяет разрабатывать иммунологические способы определения уровня гонадотропных и тире- отропного гормонов человека: ХГЧ, ЛГЧ, ФСГЧ и ТТГЧ в биологических жидкостях организма. Определение уровня указанных гормонов обеспечивает возможность-диагностики беременности у женщин на ранних сроках, диагностики ряда эндокринных нарушений процесса репродукции и скрининга новорожденных с целью диагностики гипофункции щитовидной железы. Штамм получен путем гибридизации клеток миело- м ы X 63 Ад 8.653 с клетками селезенки мыши линии BALB/C, иммунизированной официг альным препаратом ХГЧ. Сливающий агент ПЭГ 1500. Селекция гибридных клеток осуществлена на среде HAT, проведены 2 кло- нирования методом лимитирующих разведений (1 клетка на 3 лунки). Получено 100% положительных клонов. Условия выращивания клеток штамма № ВСКК (П) 398 Д: среда RPMI 1640 с 10% фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота (ФС), температура 37. С, газовая фаза - воздух с 5% COji. Способ культивирования в пластиковых флаконах на 50-250 мл, посевная доза 500000 клеток на 1 мл. Исследование МкАт осуществляют твердофазным иммуно- фер.ментным методом, в качестве антигена при этом используют препараты гормонов: ХГЧ, ЛГЧ, ФСГЧ и ТТГЧ. Через 15-20 дней после инокуляции клеток штамма в брюшную полость мыши линии BALB/C, обработанной пристанем , получают асцитическую жидкость. Путем высаливания сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией на колонках с ДЕАЕ-52 целлюлозой из 1 мл асцитической жидкости выделяют около 7 мг иммуноглобулинов, содержащие МкАт при этом составляет около 80-90%. МкАт реагируют с ХГЧ ЛГЧ. ФСГЧ и ТТГЧ в разведении 1:(105-10 ) в иммуно- ферментном и РИА тестах. МкАт, продуцируемые штаммом, реагируют также с ЛГ и ХГ лошади. МкАт не реагируют сД-субьеди- ницей ХГЧ крупного рогатого скота и свиньи. Штамм депонирован под № ВСКК.398Д. XI ю о ю о