Способ получения протопластов мицелиальных грибов Советский патент 1988 года по МПК C12N1/06 C12N1/06 C12R1/645 

со со

СП

Од О)

сл

Изобретение относится к биологии, а именно к способам ферментативного разрушения клеточной стенки мицели- альных грибов для получения прото- пластов. Предлагаемый способ может быть использован в.биохимических, микробиологических и генетических исследованиях в частности для изучения внутриклеточных ферментов и структур, локализации и секреции ферментов.

Цель изобретения - упрощение способа и увеличение выхода протопластов.

Согласно предлагаемому способу получения протопластов из мицелиальных .грибов, включающему выращивание гриба на синтетической питательной сред и инкубацию мицелия в присутствии стабилизатора в лизирующей системе, состоящей из ферментов микробного происхождения, в оптимальных условия инкубацию мицелия в присутствии стабилизатора проводят в растворе фер- ментного препарата целлоконингин ПЮх в концентрации 50-100 мг/мл при

О

20-28 С со встряхиванием в течение 5-6 ч.

Ферментньш препарат целлоконингин ПЮх содержит комплекс ферментов, включающий целлюлазу, ксиланазу, ли- тичесйие ферменты и др.

Способ осуществляют следующим образом.

В 0,2 М раствор фосфатного буфера рН 6,0-8,0 добавляют пеллоконингин П10х в концентрации 50-100 мг/мл и

стабилизатор. В полученную лизирую- щую систему помещают мицелий гриба в концентрации 80-120 мг/мл и инкубируют при 20-28°С в течение 5-6 ч при слабом встряхивании. При концентрации ферментного препарата меньшей чем 50 мг/мл и температуре ниже 20°С не происходит полного превращения мицелия в протопласты, а при концентрации большей чем 100 мг/мл и температуре выше 28 С происходит лизис мицелия без образования протопластов. Концентрация мицелия и время инкубации не являются существенными отличительными признаками способа, так как процесс не зависит от концентра- ции мицелия, а его продолжительность определяется временем полного превращения клеток в протопласты.

5

0 5

О

5

..

М

5

0

Пример 1. 6г свежевыращенного мицелия Aspergillus clavatus 1817 тщательно отмывают дистиллированной водой на воронке Бюхнера и один раз раствором 0,8М маннита в 0,2 М фосфатном буфере рН 6,2.

Полученный сырой мицелий помещают в лизирующую систему, которую готовят следующим способом.

3 г препарата целлоконингин П10х растворяют при перемешивании в течение 15 мин на магнитной мешалке в 60 мл 0,2 М фосфатного буфера рН 6,2 и нерастворившиеся частицы удаляют центрифугированием в течение 20 мин при 7 тыс.об/мин. К надосадочной жидкости добавляют маннит до конечной концентрации 0,8М. Суспензию инкубируют при 20°С в течение 6 ч при слабом встряхивании. По истечении этого срока под микроскопом видно, что практически все клетки мицелия превратились в протопласты, которые быстро в течение 2-3 мин претерпевают осмотический лизис при добавлении воды - характерньш признак протопластов. Протопласты отделяют от среды центрифугированием при, 4 тыс. об/мин. в течение 10 мин и промьшают раствором стабилизатора..

П р и М е р 2. Способ осуществляют согласно примеру 1, но используют ферментньй препарат целлоконингин П10 X в концентрации 100 мг/мл и инкубацию ведут в течение 5 ч при . В результате получают полное превращение клеток в протопласты.

Пример 3. . По 200 мг свеже- вьгращенного и отмытого мицелия помещают в 6 пробирок. В каждую пробирку добавляют по 2 мл отцентрифугирован- ного раствора целлоконингина ПЮХ в концентрации 50 мг/мп, содержащего 0,8м маннит. Первую партию пробирок (3 повторности) инкубируют при 40 С, вторую партию пробирок (З повторности) инкубируют при Результаты наблюдения в оптическом микроскопе, показывают, что в пробах, инкубированных при 40°С уже через 30 мин наблюдается полньй лизис мицелия при полном отсутствии протопластов. В пробах, инкубированных при 28 с уже через 30 мин можно видеть, что удлиненные клетки мицелия превратились в круглые, а .в поле зрения ввдны отдельные свободно плавающие протопла

сты. Процесс образования протопла™ стов заканчивается через 17-20 ч.

Пример 4. По 200 мг свежевыращенного и отмытого мицелия помещают в 6 пробирок, В каждую пробу добавляют по 2 мл отцентрифугирован- ного раствора ферментного препарата целлоконингина П10Х в концентрации 50 мг/мл, содержащего 0,8М маннит. Первую партию пробирок (3 повторно- сти) инкубируют при 28 С без встряхивания. Вторую партию пробирок (3 повторноети) инкубируют при 28°С со слабым встряхиванием. Результаты наблюдения в оптическом микроскопе показали, что в пробах, инкубированных со встряхиванием, процесс образования протопластов заканчивается через 5-6 ч, т.е. в 3-4 раза быстрее чем в пробах, инкубированных без встряхивания (17-20 ч).

После завершения процесса образования протопластов в среде вьделения при наблюдении в микроскоп не видно остатков неизмененного мицелия. Полученные протопласты стабилыл при выделении и хранении. Они не лизиру- ют в процессе центрифугирования, а в растворе стабилизатора при,4°С сохраняются без изменения в течение недели. Лизат протопластов был ис-.

пользован для выделения мембранной фракции и мембранно-связанных ферментов.

I

Преимущество предлагаемого способа заключается в том, что он позволяет получать протопласты мицелиапьных грибов с выходом 100%, при этом по сравнению с известньм упрощается процесс получения протопластов за счет использования одного ферментного препарата вместо трех.

20

15 Формула изобретения

Способ получения протопластов ми- целиальных грибов, предусматривающий вьфащивание грибов на .синтетической питательной среде, инкубацию мицелия в буферном растворе, содержащем ферменты микробного происхождения и маннит в качестве стабилизатора протопластов, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и увеличения выхода протопластов, в качестве ферментов микробного происхождения используют препарат целло- конингин П10Х в концентрации 50 - 100 мг/мл, при этом инкубацию ведут при встряхивании и температуре 20

28 С в течение 5 - 6 ч.

Изобретение относится к биологии, а именно к способам ферментативного разрушения клеточной стенки ми- целиальных грибов для получения протопластов, ,и может быть использовано в биохимических, микробиологических и генетических исследованиях. С целью упрощения процесса и увеличения выхо- да протопластов в способе, включающем выращивание гриба на синтетической питательной среде и инкубацию мицелия в присутствии стабилизатора в ли- зирующей системе, состоящей из ферментов микробного происхождения, в оптимальных условиях, инкубацию мицелия в присутствии стабилизатора проводят в растворе ферментного препарата целлоконингина П1 ОХ в концентрации 50-100 мг/мл при температуре 20-28 С QO слабЬм встряхиванием в течение 5-6 чТ Пр.еимущество предложенного способа заключается в упрощении процесса и цолучении 100%-ного выхода протопластов за сравнительно короткий срок

Составитель В. Соина Редактор М. Недолуженко Техред и.Верес Корректор А. Обручар

Заказ 2466/26

Тираж 520

БНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное