Способ получения пектолитического ферментного препарата из @ Советский патент 1981 года по МПК C12N9/14 C12N9/24 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕКТОЛИТИЧЕСКОГО

ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ИЗ ASPERGILLUS FOETIDUS

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к Ферментной м робиологической промышленности, и может быть использовано в производстве высокоактивных ферментных препаратов мацерирующего действия из технических или частично очищенных ферментных препаратов или из их раст воров, получаемых выращиванием гриба Aspergillus foetidus. Данное изобретение решает задачу получения высокоактивных ферментов, например, из Пектофоетидина ПЮх, обладающих свойствами биохимического реактива или медицинского терапевтического средства, применяемых для мацерирования растительных тканей. Известен способ пектоли тического ферментного препарата из AspergПlus feet i dus , заключающийся в приготовлении экстракта фермента, его концентрировании (обычно путем ультрафильтрации), внесении стабилизатора (Alg ( количестве 1-3%) в ферментсодержащий раствор и последующей его сушке распылением. Ферментный экстракт получают по .обычной методике, т.е. экстрагированием водой из поверхностной культуры гриба. , Пeктoлит iчecкaя активность в экстракте составляет 6 ед/мл, в конечном продукте 170-199 ед/мл (при влажности препарата 12-13%) ц1J и 12. Недостатком известного способа является невозможность получения высокоактивного пектолитического ферментного препарата (обладающего мацерирующим действием). Цель изобр.етения - повышение активности получаемого из Aspergillus foetidus пектолитического ферментного препарата. Указанная цель достигается способом получения пектолитического ферментного препарата из Aspergillus foetidus, заключающимся в приготовле

НИИ экстракта фермента, его хромате графической очистке (при активности 20-50 ед/мл исходного экстракта), концентрировании с последующим выделением целевого продукта осаждением 3-3,5 объемами органического раство;рителя.

Приготовление экстракта фермента заключается в растворении в воде Пектофоетидина П10х с активностью 100-200 ед/г в количестве 2025 весЛ в течение 12-18 ч при 3-8Рс В качестве органического растворителя для осаждения используют этиловый, пропиловый или изопропиловый спирт либо ацетон.

Хроматографическ то очистку ферментпого экстракта проводят по из- веетной методике.

Предлагаемый способ позволяет получать пектолитический ферментный препарат с активностью до 7501200 ед/г (выход по активности 60-75%).

Получаемые препараты, обладают мацерирующей активностью,, сопоетави,мой (а в некоторых случаях превывтющей) с активностью импортных препаратов, например Macerozyme R-1 Q и могут быть использованы взамен дорогостоящих импортных препаратов.

Способ осуществляется следу ощим образом.

В качестве исходного материала используют фермент Пектофо„етидш1 П1 Ох или осадок (невысушенный) , полученный спиртовым осаждением концентрата-вытяжки Пектофоетидина Их. приготовления экстракта из Пектофоетидина П10х берут концентрацию препарата в пределах 15-30%, предпочтительно 20-25%, настаивают с водой 12-18 ч при охлалодении до 3-8 С

Готовый экстракт с пектиназной активностью 22-50 ед/мл пропускают через хроматографическую колонку, наполненную гелем Акрилекс Р-2, Р-6 собранный из колонки элзоат концентрируют, например, вакуум-выпаркой или ультрафильтрацией в 3-9 раз, предпочтительно в 4-6 раз. Из полученного концентрата раствора очищенного фермента выделяют препарат осг1ждением 3-3,5 объемами органического растворителя, например этанола изопропанола или ацетона.

Дпя получения высокоактивных препаратов фермента используют культуру гриба AspergiHus foetidus или

917/5 . 4

полученные из нее препараты, iiaiii.nмер Пектофоетидин ПЮх, Нормальная работа хроматографической обеспечивается при условии, что фер5 ментньй HjienapaT Пектофоетидин П10х обладает активностью 100-200 ед/г и полученный из него экстракт активностью предпочтительно 40-50 ед/мл. - При этом получают препарат с активностью до 1000 ед/г и вьппе. Если концентрация Пектофоетидина ПЮх в экстракте выще 30%, то получают плохо фильтруемые и трудно центрифугируемые экстракты, непригодные для

Хроматографию осуществляют используя одновременное нагнетание раствора снизу и отсасьшание сверху колонки, производят вымьшание высокомолекулярного вещества - фермента - элю ирузощим раствором, взятым в количестве 40-;50% от полного объема колонки, со скоростью подачи его в два раза превышающей скорость подачи раствора высокомолекулярного вещества. На данной стадии очистки фермента достигается отделегше от низкомолекулярных примесей (солей, аминокислот, углеводов и др.). В качестве наполнителя колонки используют полиакриламидные гели типа Акрилекс. Из них Акрилекс Р-2 обеспечивает наибольшую скорость процесса, быстроту регенерации и более многократное использование, С Акрилексом Р-6 получают более качественное отделение пигментов, но скорость хроматографии на этом геле в 2-3 раза ниже, чем на Акрилексе Р-2. В качестве элюирующего раствора используют воду с небольшими добавками солей или без них.

Полученный из колонки элюат, раствор очищенного фермента, по частям или целиком подвергают концентрированию. Концентрирование осуществляют в 3-9 раз известным способом (вакуум-выпарка или ультрафильтрация).

50 Эта стадия необходима для сниже1шя

объема жидкости, увеличения концентрации фермента и уменьшения расхода органического растворителя. После концентрирования в 3-9 раз фермент

.55 может быть полиостью и без инактивации осажден ,5 объемами органического растворителя, например этанола, изопропанола, ацетона. . 5 Пример 1. Для пршотоБления 25%-ного экстракта 0,25 кг Пектофоетидина ПЮх с активностью 120 ед/г, полученного с Рарсказовского биохимического завода, смешивают с 0,75 л воды и оставляют в холодильнике (3-8 с) стоять в течение 16 ч. Центрифугированием отделяют нерастворившуюся часть и получают 0,75 л экстрак та. Весовая концентрация экстракта 0,5 л фракции упаривают на роторном испарителе при температуре 40 С и получают 0,078 л концентрата с активностью 265 ед/мл, выход количественный. Степень концентрирования 6,4 раза, К 0,078 л концентрированного элюа та при 0-5 С добавляют 0,23 л (3 объ ема) этанола, предварительно охлажденного до 0-5 С, перемешивают 15 мин, осадок отделяют центрифугированием при 2500 об/мин (10 мин). Осадок высушивают в вакууме. Выход 11,2 г, активность 1200 ед/г, выход по активности на стадии концентрирования спиртового осаждения и высушивания 75%. Общий выход пектиназы в расчете на исходный Пектофоетидин П10х составляет 60%. Пример 2. Для приготовления 20%-ного экстракта 0,2 кг пектофоетидина ПЮх с активностью 204 ед/г полученного с Рассказовского биохимического завода, смешивают с 0,8 л воды и оставляют на 17 ч при 5 С, центрифугируют в течение 45 мин при 2500 об/мин,получают экстракт объем 0,65 л с активностью около 50 ед/мл Весь экстракт вводят в колонку (6,3x1 м) с гелем Акрилекс Р-2 и собирают две фракции объемом: I 1 ,0 л, 1-0,2 л. Фракцию 11 лиофилизируют и получают 7 г препарата с 5 по отношению к исходному ферментному препарату составляет 25%, активность в экстракте равна 36 ед/мл, общий выход на стадии составляет 90%. 0,68 л экстракта пропускают через колонку с гелем Акрилекс Р-2 (диаметр колонки 10 см, высота около 100 см) в соответствии с известным способом. Собирают три фракции. Результаты показаны в табл.1. Таблица 1 активностью-более 2000 ед/г. Фракцию 1 концентрируют упариванием в 4,4 раза до объема 0,23 л. Концентрат делят на три части по 0,076 л каждая и из каждой части выделяют препараты, добавляя этиловый, пропиловый и изопропиловый спирты к каждой части соответственно. Осаждение фермента спиртами осуществляют следующим образом. К охлажденному до 5°С концентрату (0,076 л) добавляют при перемешивании 0,18 л (3,5 объема J спирта, охлажденного до температуры (-5)(-15)с. Смесь перемешивают и через 10-15 мин центрифугируют. Все три препарата имеют вес около 2,7 г каждый и их активность в пределах 750-850 ед/г. Наиболее светлый осадок получается с этиловым спиртом. Пример 3. Приготовление экстракта и хроматографию на колонке с Акрилексом Р-2 осуществляют так же, как в примере 1. Далее 0,95 л элюата с активностью 10160 ед/л разделяют на две части 0,18 и 0,77 л соответственно. Первую часть подвергают ультрафильтрации через мембрану М-20 (Амикон) под давлением 6,7 атм до объема 0,036 л в концентрате (кратность концентрирования 5) , из которого фермент осаждают добавлением трех объемов