Способ получения иммобилизованных люминесцентных бактерий РнотовастеRIUм FISснеRI штамм 6 Советский патент 1988 года по МПК C12N11/08 

;О

сд

О5

|

00

Изобретение относится к химии полимеров и биотехнологии, а именно к способу ковалентной иммобилизации клеток, и может быть использовано S технике, в частности для создания Обладакицих повышенным временем деист- Вия датчиков для определения различны примесей в растворах, на основе иммобилизованных клеток морских люминес -. центиых бактерий PhotobacteriuM fishe ri (КМПБ)о

Цель изобретения - увеличение длительности использования иммобилизован клеток за счет повьшения времени ipx свечения о

I Способ заключается в ковалентной иммойшизации клеток путем обработки их водной суспензии ацилирующим аген- VOM, в качестве клеток используют клетки морских люминесцентных бактерий Photobacterium flsheri штамм б, в качестве ацилируняцего агента - лрквитой сополимер синтетического полмера и хлорангидрида (мет)акриловой кислоты, содержащий 50-170 мас,% привитого олигохлорангидрида с .мо лекулярной массой 1000-1600, и обра- iSoTKy суспензии клеток проводят из засчета 1 мл суспензии, содержащий 10 - 10 клеток, на 1-2 см поверх™ ости привитого сополимера ; Получение иммобилизованных кле- JTOK (люминесцирующего полимерного 1атериапа) проводят в две стадии о

На первой стадии получают приви- гой сополимер синтетического сополимера и хлорангидрида (мет)акриловой 1СИСЛОТЫ под действием у -облучения из газовой фазы дозой 2,0-5,0 Мрадо

На второй стадии проводят ое)работ- КУ привитого сополимера водной суспензией клеток с концентрацией 10-10 клеток/мл суспензии Выбор данного интервала концентраций клеточной сус- пензии обусловлен тем, что количество вводимых на поверхность клеток (и, как следствие, интенсивность люминесценции материала не изменяется при более высокой их концентрации в сус- пензии, при концентрации суспензии клеток менее iO клеток/мп не достигается насыщения поверхности привитого сополимера иммобилизируемыми (слетками,

Обработку привитого сополимера суспензией КМПБ проводят путем погружения привитого материала в суспензию клеток в 0,05 М фосфатном буфере

0 5

0

5 Q

5

содержащем 0,3 М хлорида натрия (рН 7,8) при на 16-20 ч из расчета 1 мл суспензии клеток на 1т 2.

z см привитого сополимера, так, чтобы вся его поверхность была погружена в суспензию клеток

В качестве исходных полимеров возможно использование следующих классов полимеров: полиолефинов, полиэфиров , полиамидов , полиакрипатов и-пр При этом может быть использована любая форма полимеров; пленки, волокна, гранулы, сложнопрофильные изделия ия блоков.полимеров, порошки

Способ позволяет увеличить длительность использования иммобилизованных клеток за счет повьш1ения времени их свечения до 30-40 ч (вместо 8 ч для интактных клеток и менее часа для иммобилизованных известным способом),

Пример 1о Обезжиренную этанолом пленку из полиэтилена (ПЭ) площадью 100 см помещают в специальную ампулу с перетяжкой, в нижнюю часть которой заливают 1 мл хлорангидрида метакриповой кислоты (МАХ) так, чтобы жидкость не соприкасалась с полимером. Ампулу вакуумируют до остаточного давления торр, запаивают и облучают Jf-излучением (источник излучения °Со, установка типа ГУРХ)мощностью дозы 0,5 Мрад/ч до общей дозы 2,5 Мрад Во время облучения нижнюю часть ампулы экранируют свинцовой защитой для предотвращения гомополимеризации хлорангидрида

После облучения ампулз вскрывают, пленку промывают абсолютированным эфиром для удаления непрореагировавшего хпорангидрида и высушивают Количество привитого МАХ со средней длиной цепи 16 мономерных звеньев (молекулярной массой 1600)составляет 4,40 10 г/см поверхности пленки

Привитой сополимер инкубируют в течение 20 ч при 4°С в суспензии КМПБ Photobacterium fisheri штамм 6 в 0,05 М фосфатном буфере, содержащем 0,3 М хлорида натрия (рН 7,8), концентрацией 10 клеток/мп суспензии На 1 см привитой пленки берут 1 мл суспензии клеток так, чтобы вся поверхность пленки бьта покрыта жидкостью

привитую пленку после иммобилизации промьтают М фосфатным буфером, также содержащим 0,3 М хлорида натрия (рН 7,8), до прекращения свечения промывных вод, определяемого на фотометре по интенсивности люминесценции неиммобилизованных смытых клеток, помещают в термостатированную ячейку (24 С) с постоянным перемешиванием и измеряют интенсивность люминесценции на фотометре с ФЭУ, IQ откалиброванном в области длин волн 480-500 нМо Время, за которое интенсивность люминесценции уменьшается на 50% (время свечения люминесцирующего материала), составляет 38 ч. Время 15 ,0 г привитого олигомера на 1 см свечения контрольной суспензии интакт- (или 8,80 г на 2 см). Время жизни

минесценции пленки мгновенно падает до О,

Пример 12о Все операции про дят как в примере 11, добавляя масо% акриламида. Интенсивность люминесценции мгновенно падает до О

Приме р13о Все операции про водят как в примере 1, используя су пензию клеток, содержащую 10 млн„ клеток/мл, взятую в количестве 50 м на общую площадь пленки 100 см, составляет 1 мл суспензии на 2 см поверхности пленки. Пленка содержит

чт

г

,0 г привитого олигомера на 1 см (или 8,80 г на 2 см). Время жизни

минесценции пленки мгновенно падает до О,

Пример 12о Все операции провдят как в примере 11, добавляя масо% акриламида. Интенсивность люминесценции мгновенно падает до О

Приме р13о Все операции проводят как в примере 1, используя суспензию клеток, содержащую 10 млн„ клеток/мл, взятую в количестве 50 мл на общую площадь пленки 100 см, составляет 1 мл суспензии на 2 см поверхности пленки. Пленка содержит

что

г

Изобрет.ение относится к области химии полимеров и биотехнологии и может быть использовано в аналитической химии для определения примем сей органических соединений в растворах Цель изобретения - увеличение длительности использ.ов ания иммобилизованных клеток за счет повышения времени их свечения„ Способ заключается в обработке суспензии клеток морских люминесцентных бактерий Photo- bacterium fisheri штамм 6 привитым сополимером синтетического полимера и хлорангидрида (мет)акриловой кислоты, содержащим 50-170 маСа% привитого олигохлорангидрида с моЛоМ 1000- 1600, из расчета 1 мл суспензии, содержащей 10 - 10 клеток на 1-2 см привитого сополимерао Время свечения целевого продукта составляет 30-40 ч 1 табЛо i СЛ

ных клеток в тех же условиях - 8 ч.

Примеры 2-8о Все операции осуществляют аналогично примеру 1 о

Данные опытов по примерам приве- 20 дены в таблице.

П р и м е р 9о ПЭ-пленку, не подвергнутую привитой сополимеризации с МАХ, выдерживают 20 ч при 4 С в суспензии КМЛБ (условия аналогичны при- 25 меру 1) и определяют время свечения сорбированный клеток. Время свечения составляет 9ч, после чего практически все иммобилизованные некова- лентно (сорбированные) клетки вымы- 30 лись с поверхности полимерного материала

Пример 10(сравнительный по прототипу). К суспензии 10 мл КМЛБ

клеток 39 Чо

Пример 14, Все операции проводят как в примере 1, используя суспензию, содержащую 10 млн, клеток/мл, в количестве 50 мл на 100 см поверхности (или 1 мл на 2 см). Время жизни клеток 32 ч.

Пример 15 (контрольный)о Все операции проводят как в примере 1, используя 4 мл суспензии клеток с содержанием клеток 10 млн/мл на 2 см поверхности пленки. Время жизни клеток составляет 40 ч, Тое, не увеличивается при увеличении соотношения объем суспензии клеток: i- 2 см поверхности.

Пример 16 (контрольный), Все операции аналогичны операциям примера

в 0,05 М фосфатном буфере, содержащем 35 ° используют суспензию с концентрацией 10 млно клеток/ 2 см поверхности в количестве 1 мл. Время свече- 12ч,

0,03 м хлорида натрия (рН 7,8) содержащей 10 клеток/мл, добавляют при постоянном перемешивании при 4 С 100 мкл (0,01 г) МАХ, доводят смесь до комнатной температуры, до- 40 бавляют 1 г АА, 0,1 г БИС и полимери- зуют под действием системы персульфат калия - метабисульфит калия в течение 1 ч. Получают гель с кова- лентно иммобилизованными клетками 45 КМЛБ в виде пленки. Интенсивность люминесценции полимерного материала с ковалентно иммобилизованными данным способом КМЛБ составляет О, Препарат не обладает свойствами люминесцирую- 50 щего полимерного материала, поэтому время свечения его определить невозможно .

Пример 11, Пленку с иммобили- gg зованными КМЛБ помещают в термостатированную ячейку (температура 24 С) и к фосфатному буферу добавляют 10 моль диоксана. Интенсивность люния клеток

Пример 17 (контрольный), Все операции проводят как в примере 1, используя соотношение 0,5 мл суспензии с концентрацией 10 млн/мл на 1 см поверхности Время свечения 40 ч, т,е, увеличение концентрации суспензии вьше 10 млн клеток/мл не приводит к увеличению времени жизни.

Среднее значение площади поверхности пленок изменяется в пределах от 1 до 100 большие площади не удается поместить в установку для облучения типа ГУРХ, Площадь поверхности порошка полиамида в примере 6 - 10 .

Прим

е р

мл

суспензии б

18, К 1

с содержанием интактных клеток 10 на 1 мл добавляют водный раствор изопропанола и регистрируют изменение

клеток 39 Чо

Пример 14, Все операции проводят как в примере 1, используя суспензию, содержащую 10 млн, клеток/мл, в количестве 50 мл на 100 см поверхности (или 1 мл на 2 см). Время жизни клеток 32 ч.

Пример 15 (контрольный)о Все операции проводят как в примере 1, используя 4 мл суспензии клеток с содержанием клеток 10 млн/мл на 2 см поверхности пленки. Время жизни клеток составляет 40 ч, Тое, не увеличивается при увеличении соотношения объем суспензии клеток: i- 2 см поверхности.

Пример 16 (контрольный), Все операции аналогичны операциям примера

° используют суспензию с концентрацией 10 млно клеток/ 2 см поверхности в количестве 1 мл. Время свече 12ч,

ния клеток

Пример 17 (контрольный), Все операции проводят как в примере 1, используя соотношение 0,5 мл суспензии с концентрацией 10 млн/мл на 1 см поверхности Время свечения 40 ч, т,е, увеличение концентрации суспензии вьше 10 млн клеток/мл не приводит к увеличению времени жизни.

Среднее значение площади поверхности пленок изменяется в пределах от 1 до 100 большие площади не удается поместить в установку для облучения типа ГУРХ, Площадь поверхности порошка полиамида в примере 6 10 .

Прим

е р

мл

суспензии б

18, К 1

с содержанием интактных клеток 10 на 1 мл добавляют водный раствор изопропанола и регистрируют изменени

интенсивности свечения клеток в зависимости от концентрации спирта Полное тушение люминесценции наблюдается при конечной концентрации ингибитора (159-0,1)10 моль/л е

Пример 19. 1 см пленки (полученной по примеру 3), содержащей 10 иммобилизованных клеток, помещают в раствор, содержащий изопропанол и ю регистрируют свечение пленки в зависимости от концентрации спирта Полире тушение люминесценции наблюдается конической концентрации ингиби- моль/л.

13956736

билизованным КМЛБ, обладающие функциональной активностью .и порышенным временем свечения клеток (до 30-40 ч), целевой продукт может быть использован для индикации органических примесей в растворах.

Аналогичт ра (2,140,О- 10нрй чувствительностью обладают клетки, полученные по примерам 1-2, 4-8, следовательно, чувствительность ин- т ктных и ковалентно иммобилизованных

15

Формула изобретения

Способ получения иммобилизованных люминесцентных бактерий Photobacteri- um fischeri щтамм 6, включающий обработку водной суспензии бактерий органическим ацилирующим реагентом, проведение иммобилизации с использованием органического полимера, отделение полученных клеток от реакционной

тИчески одинаковаt

смеси, отличающийся KJneTOK к гидрофобным молекулам прак- 20 тем, что, с целью увеличения длительности использования иммобилизованных клеток за счет повышения времени их свечения, иммобилизацию проводят путем обработки ацилирующим реагентом, в качестве которого используют пр ивитой сополимер синтетического полимера и хлорангидрида (мет)акриловой кислоты, содержащий 50 - 170 масД по массе привитого

; Таким образом, как нативные, так И: иммобилизованные клетки оказываются о|цинаково чувствительными к гидрофоб- 25 rtiiM соединениям

Выход обладающих люминесцен.ций клеток цри иммобилизации предложенным сЬособом составляет 60-70% от их ис- хЬдного количества, что определяется ЗО подсчетом клеток в исходной и конечной суспензияхо

i Таким образом, изобретение позволя- е|т получить люминесцирующие поли- М1ерные материалы с ковалентно иммоолигохлорангидрида с мол.м. 1000 - 1600 дйльтон, причем обработку суспензии клеток проводят из расчета 1 мл суспензии, содержащей от 10 до 10 клеток на 1-2 см поверхности привитого сополимера

Полиэтилен, пленка

Попиэтипентерефтапат, пленка

Полипропилен, вопокно

Найлон-Ъ,6-,

ЕОЛОККО

Полюшметип- силоясая,

МАХ

АХ

КАХ

МАХ

АХ

Полиеммл t граиулк д«иметром 0,1 МП АХ

2,54,40501616001,01038

3,04,93781311001,

5,05,941701010001,01о 30

.3,05,02.831414000,

2,54,26561515000,

2,54,43611515000,

Формула изобретения

Способ получения иммобилизованных люминесцентных бактерий Photobacteri- um fischeri щтамм 6, включающий обработку водной суспензии бактерий органическим ацилирующим реагентом, проведение иммобилизации с использованием органического полимера, отделение полученных клеток от реакционной

олигохлорангидрида с мол.м. 1000 - 1600 дйльтон, причем обработку суспензии клеток проводят из расчета 1 мл суспензии, содержащей от 10 до 10 клеток на 1-2 см поверхности привитого сополимера

Физико-механическиесвойства нс- хояньск полимеров и модифицированныхпрактически одинаковы

АХ

М&Х

2,0 2,93 Z5

6,0 7,35200

Малая эффективность имнобялиэашт. Деструкция полимера. Полиая (есорбция клеток аа 9 ч

Продолжение таблнць

1800 2,5

8901,0

О1,0

10

10 1о8

,2-Jfr

9