СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕАЗ Советский патент 1998 года по МПК C12N11/08 C12N9/50 

Изобретение относится к химии полимеров и химической энзимологии, а именно к способам иммобилизации ферментов на полимерных матрицах.

Известен способ иммобилизации ферментов, в том числе сериновых протеаз, на полимерных матрицах путем радиационной привитой сополимеризации полимера с непредельным соединением, содержащим реакционноспособные группы, c последующей обработкой привитого сополимера активатором и раствором фермента, по которому в качестве непредельного соединения используют аллиламин, а в качестве активатора глутаровый диальдегид [1]
Недостатком этого метода является необходимость использования активатора, что в определенной степени усложняет процесс, невозможность иммобилизации больших количеств фермента, поскольку аллиламин относится, как известно, к числу труднополимеризуемых мономеров по радиальному механизму и вследствие этого обладает невысокой эффективностью при прививке на полимерной подложке, в связи с чем активность получаемых продуктов является недостаточно высокой и не превышает 50% от активности нативных ферментов.

Целью изобретения является повышение активности получаемых препаратов - иммобилизованных сериновых протеаз, упрощение технологии их получения.

Поставленная цель достигается описываемым способом иммобилизации сериновых протеаз на полимерных матрицах путем радиационной привитой сополимеризации полимера с непредельным соединением, содержащим реакционноспособные группы, и последующей обработки привитого сополимера раствором фермента, причем в качестве непредельного соединения, содержащего реакционноспособные группы, используют хлорангидриды α, β ненасыщенных одноосновных карбоновых кислот (например, акриловой или метакриловой кислоты).

Радиационную привитую сополимеризацию обычно проводят под действием g-излучения с дозой 1,0-4,0 Мрад.

Существенным отличием данного способа является использование в качестве непредельного соединения, содержащего реакционноспособные группы, хлорангидридов a,β -ненасыщенных одноосновных карбоновых кислот.

Процесс ковалентной иммобилизации ферментов на полимерных матрицах проводят в две стадии. На первой стадии на полимер под действием g- излучения прививают соответствующий хлорангидрид кислоты (доза g -излучения от 1,0 до 4,0 Мрад, при этом степень прививки 30-150 мас.), при меньших степенях прививки активность иммобилизованных ферментов невелика, даже чрезвычайно мала, при больших степенях прививки происходит радиационное сшивание прививаемого компонента, и он становится нереакционноспособным по отношению к иммобилизуемому ферменту. Доза облучения в каждом случае индивидуальна и определяется не только химической природой используемого полимера, но и его фазовым состоянием, и для пленки, порошка и волокна полимера одной и той же природы она существенно различается, что зависит от способа прививки. На второй стадии проводят обработку привитого сополимера раствором фермента в соответствующем буфере.

В качестве полимерной матрицы в описываемом способе возможно использование следующих классов полимеров: полиолефинов, полиэфиров, полиуретанов, полиамидов, полиакрилатов и полиметакрилатов и других в виде пленок, волокон, гранул и порошков.

Пример 1. Обезжиренную полиэтиленовую пленку площадью 31,7 см² помещают в ампулу с перетяжкой, на дно которой наливают 1 мл хлорангидрида акриловой кислоты. Ампулу вакуумируют до давления 10^-3 тор, запаивают и облучают g-излучением (источник Co⁶⁰с мощностью дозы 0,5 Мрад/ ч до общей дозы 1,5 Мрад). Ампулу вскрывают, привитую пленку промывают абсолютированным эфиром и выдерживают 20 ч в растворе трипсина, концентрация раствора 1 мг/мл в бикарбонатном буфере (pH 9,1) при 4^oC так, чтобы вся поверхность пленки была покрыта раствором фермента. Пленку промывают бикарбонатным буфером, 1 M раствором NaCl и дистиллированной водой до тех пор, пока промывные растворы не будут давать поглощения при 280 или 220 нм (определяется спектрофотометрически).

Протеолитическую активность пленки определяют, используя в качестве субстрата 1% -ный раствор казеина в трис-NCl-буфере, выражая ее в мкг тирозина/мин•10 см². Активность иммобилизованного трипсина составляет 0,189 мкг тирозина/мин • 10 см².

Примеры 2-5. В 3 ампулы помещают полиэтиленовую пленку (образцы площадью 36,4; 36,7; 36,7; 37,2 см²) и проводят радиационную привитую сополимеризацию с хлорангидридом акриловой кислоты также, как в примере 1, используя источник с мощностью дозы 2 Мрад/ч и облучая ампулы до общей дозы 1; 1,5; 3,0; 4,0 Мрад соответственно. Иммобилизацию трипсина проводят также аналогично примеру 1. Активность иммобилизованного фермента составляет 0,176; 0,014; 0,0666 и 0,004 мкг тирозина/мин•10см² соответственно.

Пример 6. В ампулу помещают порошок полиакриламида (0,9137 г). Ампулу облучают до общей дозы 2,5 Мрад, мощность дозы 0,5 Мрад/ч. Затем проводят иммобилизацию a-химотрипсина, как в примере 1. Активность иммобилизованного фермента представляет 0,0176 мкг тирозина/мин•г носителя.

Пример 7. На полиэтиленовую пленку площадью 36,4 см² прививают хлорангидрид метакриловой кислоты, используя источник с мощностью дозы 0,5 Мрад/ч и облучая ампулу до общей дозы 1,5 Мрад. Иммобилизацию трипсина проводят, как в примере 1. Активность иммобилизованного фермента составляет 0,143 мкг тирозина /мин•10 см².

Пример 8. На полипропиленовую пленку площадью 32,6 см² прививают хлорангидрид метакриловой кислоты; общая доза облучения 1 Мрад, мощность дозы 2 Мрад/ч. Иммобилизацию трипсина проводят, как в примере 1. Активность иммобилизованного фермента составляет 0,812 мкг тирозина/мин•10 см².

Пример 9. На образец полиметилметакрилата площадью 15,3 см² прививают хлорангидрид метакриловой кислоты; общая доза облучения 1 Мрад, мощность дозы 2 Мрад/ч. Иммобилизацию трипсина проводят как в примере 1. Активность иммобилизованного фермента составляет 0,217 мкг тирозина/мин • 10 см².

Пример 10. На образец целлюлозы весом 2,1 г прививают хлорангидрид акриловой кислоты; общая доза 1 Мрад, мощность дозы 2 Мрад/ч. Иммобилизацию трипсина проводят, как в примере 1. Активность иммобилизованного фермента составляет 0,304 мкг тирозина/мин•г носителя.

Пример 11. На полиуретановую пленку площадью 15,5 см² прививают хлорангидрид акриловой кислоты; общая доза 1 Мрад, мощность дозы 2 Мрад/ч. Иммобилизацию трипсина проводят, как в примере 1. Активность иммобилизованного фермента составляет 0,128 мкг тирозина/мин• 10 см².

Пример 12. На порошок полиакриламида весом 0,8966 г прививают хлорангидрид акриловой кислоты; общая доза облучения 2 Мрад, мощность дозы 0,3 Мрад/ч. Иммобилизацию фибринолизина проводят как в примере 1. Активность иммобилизованного фермента составляет 0,216 мкг тирозина/мин • г носителя.

Пример 13. На порошок полиакриламида весом 0,9112 г прививают хлорангидрид акриловой кислоты; общая доза 2 Мрад, мощность дозы 0,3 Мрад/ч. Иммобилизацию протеазы проводят, как в примере 1. Активность иммобилизованного фермента составляет 0,270 мкг тирозина/мин•г носителя.

Свойства иммобилизованных ферментов представлены в таблице.

Таким образом, описываемый способ иммобилизации сериновых протеаз позволяет получать препараты с высокой активностью (80-90%) и является более простым, чем известный. Препарат, полученный данным способом, сохраняет при хранении до 90% активности.

1. Способ иммобилизации сериновых протеаз на полимерных матрицах путем радиационной привитой сополимеризации полимера с непредельным соединением, содержащим реакционноспособные группы, и обработки полученного привитого сополимера раствором фермента, отличающийся тем, что, с целью повышения ферментативной активности получаемого продукта и упрощения процесса, в качестве непредельного соединения, содержащего реакционноспособные группы, используют хлорангидрид α,β-ненасыщенных одноосновных карбоновых кислот.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве хлорангидридов α,β-ненасыщенных одноосновных карбоновых кислот используют хлорангидриды акриловой кислоты или метакриловой кислоты.

3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что радиационную привитую сополимеризацию проводят под действием γ -излучения с дозой 1,0 - 4,0 Мрад.

1. Способ иммобилизации сериновых протеаз на полимерных матрицах путем радиационной привитой сополимеризации полимера с непредельным соединением, содержащим реакционноспособные группы, и обработки полученного привитого сополимера раствором фермента, отличающийся тем, что, с целью повышения ферментативной активности получаемого продукта и упрощения процесса, в качестве непредельного соединения, содержащего реакционноспособные группы, используют хлорангидрид α,β-ненасыщенных одноосновных карбоновых кислот. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве хлорангидридов a,β-ненасыщенных одноосновных карбоновых кислот используют хлорангидриды акриловой кислоты или метакриловой кислоты. 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что радиационную привитую сополимеризацию проводят под действием g -излучения с дозой 1 4 Мрад.