Способ диагностики вирусных гепатитов Советский патент 1989 года по МПК G01N33/53 

1

Изобретение относится к медицине, касается гепатологии, в частности вопросов иммунологической диагностики вирусных гепатитов А (ВГА) и В (ВГВ).

Цель изобретения - повышение точности диагностики вирусных гепатитов.

Способ осуществляют следующим об- разом.

Из крови выделяют лимфоцитарную взвесь в градиенте плотностиг фиколл- верографина. Эту взвесь, доводят до концентрации 210 ,кл/мл в растворе Хзнкса (рН 7,2). В 12 пробирок вносят по 100 мкл суспензии лимфоцитов в концентрации 210 кл/мл, в 4 из них добавляют HAAg в концентрации 20 мкг/мл и в 4 пробирки - HBgAg в концентрации 20 мкг/мл (по белку).

Все пробы ставят в термостат при 37 С. По 1 пробирке из каждой группы (контрольные лимфоциты, с HAAg и с HBgAg), вынимают через 5; 30; 60 и 90 мин, добавляют раствор акридинового оранжевого (концентрация 10 М на ацетатном буфере, рН 4,4), смешивают, через 10 мин наносят на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и закрепляют парафином. Цитофотометрические измерения препарата проводят на зондовом цитофотометре при Л е 365 нм и длине волны 530 нм. На каждом препарате флюоресценцию 30-50 клеток измеряют и подсчитывают среднее значение интен-, сивности флюоресценции. Высчитывают нарастание интенсивности флюоресценции в опыте по сравнению с контролями и этот показатель используют для диагностики ВГА и ВГВ.

При нарастании флюоресценции более 25% в пробе с HBgAg диагности у- ют ВГВ, при нарастании флюоресценции более 25% в пробе с HAAg .диагностируют ВГА.

влиянием HBgAg на 2% - отрицательный результат. При использовании предлагаемого способа в пробе с HBsAg (20 мкг/мл) наблюдалось повышение интенсивности флюоресценции

на 25% на 30-й мин инкубации при 37°С; в опытах с HHAg интенсивность флюоресценции не изменилась. При проПримерь Больная А. предъяв- ю ведении способа в нестандартных ус- ляла жалобы на недомогание, ломотуловиях (использовании HBgAg в конв суставах, тошноту (в

суставах, тошноту в анамнезе - три месяца назад внутримышечные инъекции) . Объективно: желтушность склер и кожи, повьпиение уровня билирубина, АлАТ. Произведено обследование с помощью известного и предлагаемого способов. При применении способа-прототипа наблюдалось торможение прилипания в опытном (обработанном HBgAg) образце лимфоцитов по сравнению с контрольным, которое составляло 3%, т.е. получен отрицательный результат. При использовании предлагаемого способа при Инкубации лимфоцитов в центрации 2-10 кл/мл в течение 60 мин при 37° С с HBsAs интенсивность флюоресценции акридино.вого оранжевого повысилась на 150%, инкубация лимфоцитов с HAAg в аналогичных условиях не дала увеличения флюоресценции акридинового оранжевого. Проведение предлагаемого способа с использованием лимфоцитов в концентрации

20

центрации 50 мкг/мл) интенсивность флюоресценции повысилась лишь на 15%. На основании данных, полученных 15 предлагаемым способом, был диагностирован ВГВ. Диагноз был подтвержден тем, что в сыворотке крови встречным нммуноэлектрофорезом.обнаружен HBgAg.

Примерз. Больной Б. предъявлял жалобы на слабость, тошноту, боли в правом подреберье. Объективно: желтушность склер и кожи, повьш1е- ние билирубина и АлАТ. С помощью спокон- 25 соба-прототипа не представлялось воз- можнь1М у Е-очнить диагноз. .С помощью предлагаемого способа было обнаружено отсутствие изменения интенсивности флюоресценции при обработке лимфоци- 30 тов HBgAg и повышение на 30% связьта- ния акридинового оранжевого под действием HAAg.

Применение неоптимальных условий (инкубация лимфоцитов с HAAg и HBgAg

кл/мл позволило выявить измене- gg в течение 2.мин) позволило выявить ние интенсивности флюоресценции акри- нарастание интенсивности флюоресценции под влиянием HAAg на 10%, что позволило диагностировать ВГА. Циагноз подтвержден отсутствием HBgAg в сыво- 40 ротке крови при регулярном контроле (каждые О дней) и обнаружением IgM антигенов-антител . (иммуноэнзимный метод, набор фирмы Эббот),

С помощью способа-прототипа в 45 разгаре ВГВ правильный диагноз был поставлен.в 5 из 9 случаев, в рекон- валесценции - .в 3 из 9 случаев. Способ-прототип не позволяет диагностировать ВГА, поскольку он не адапти- cQ рован к использованию антигена вируса гепатита А.

С помощью предлагаемого способа верный диагноз ВГВ и ВГА в период, разгара и реконвалесценции был .по- gg ставлен у 100% больных. Правильность диагноза ВГА и ВГВ подтверждена кли- нико-беохимическими и иммунологичесдинового оранжевого на 15% при обработке HBgAg и отсутствие изменения под действием HAAg. Таким образом способ позволил диагностировать ВГВ., при этом концентрация лимфоцитов 510 кл/мл оказалась неоптимальным условием постановки реакции.

В сьшоротке крови больной методом встречного иммуноэлектрофореза выявлен HBgAg, чем подтверждена правильность выставленного диагноза, .

П р и м е р 2. Больной П. предъявлял жалобы на боли в правом подребе- рье, тошноту (в анамнезе - парентеральные вмешательства). Г оспитализи- рован с подозрением на вирусный гепатит. Объективно: желтушность кожных покровов и склер, повышение билирубина и АлАТ.

Обследован с помощью известного и предлагаемого способов. При применении способа-прототипа выявлено торможение прилипания лимфоцитов под

кими .исследованиями больных на протяжении 1-3 мес заболевания.

58827

влиянием HBgAg на 2% - отрицательный результат. При использовании предлагаемого способа в пробе с HBsAg (20 мкг/мл) наблюдалось повышение интенсивности флюоресценции

на 25% на 30-й мин инкубации при 37°С; в опытах с HHAg интенсивность флюоресценции не изменилась. При прокими .исследованиями больных на протяжении 1-3 мес заболевания.

51458827

Таким образом, предлагаемый способдополнительно берут пробу с лимфоципозволяет достоверно диагностироватьтами, добавляют в нее вирус гепативирусные гепатиты А и В в стадиях та А, далее обе пробы инкурируют в

разгара и реконвалесценции,gтечение 5; 30; 60 и 90 мин при 36Формула изобретения38 С, далее окрашивают раствором акСпособ диагностики вирусных ге-ридинового оранжевого, оцределяют

патитов, включающий забор у больногоинтенсивность флюоресценции ядер и

крови, выделение лимфоцитов, добавле-при нарастании флюоресценции по сравние HBs антигена и инкубирование,юнению с пробами бе антигенов более

отличающийс я тем, что, счем на 25% диагностируют соответстцелью повьппения точности способа,венно гепатит А или гепатит В.

Изобретение относится к вирусологии. Цель изобретения - повышение точности диагностики. Суспензию лим- фоцитов вносят в пробирки и в четыре из них добавляют вирус гепатита А. В следующие 4 пробирки вносят вирус гепатита В. Все пробы ставят в термостат. Из каждой группы вынимают по пробирке через 5; 30; 60 и 90 мин, добавляют раствор акридинового оранжевого, смешивают и наносят на .предметное стекло. Проводят питофотомет- рическое измерение препарата. При нарастании флюоресценции более 25% в пробе с вирусом гепатита В диагностируют вирусный гепатит В. Способ позволяет достоверно диагностировать заболевание в стадиях разгара и рекон- ралесценции. (Л