СПОСОБ СЕРОДИАГНОСТИКИ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА ЧУМНОГО МИКРОБА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для серодиагностики возбудителя чумы за счет обнаружения капсульного антигена (фракции 1) в реакции непрямой суспензионной агглютинации (РНСА).

Изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в обеспечении возможности проведения экспрессной и окончательной серодиагностики капсульного антигена, поэтапного контроля диагностических феноменов в опытных и контрольных пробах, повышении степени достоверности результатов реакции при постановке одной серологической реакции, выполняемой объемным методом в лунках планшета для иммунологических реакций.

Известен способ постановки гемагглютинационного теста в серодиагностике на обнаружение капсульного антигена чумного микроба в реакции, выполняемой объемным методом реакции пассивной гемагглютинации (РПГК) с использованием диагностикума чумного иммуноглобулинового эритроцитарного. Серодиагностика основана на учете соединения антигена с антителом, что выражается в склеивании эритроцитов, на которых адсорбированы антитела к капсульному антигену. При этом склеенные эритроциты выпадают в виде осадка, равномерно покрывающего дно лунки, которому дано наименование "зонтик", и что оценивается как положительный результат реакции. При отсутствии склеивания и выпадении эритроцитов на дно лунки в виде "пуговки" результат реакции считается отрицательным. (Наумов А.В. Самойлова Л.В. Лабораторная диагностика чумы. - Саратов 1992 г. С. 17-21; Инструкция по применению диагностикума эритроцитарного чумного иммуноглобулинового сухого и жидкого. Утв. Зам. Начальника Главного управления карантинных инфекций Минздрава СССР. 07.07.1987 г.) Однако такой способ длителен по времени получения результата: предварительный учет результата производят через 2-4 ч, а окончательный - через 24 ч. Для ускоренной идентификации возбудителя чумы применяют реакцию гемаггломерации (РГА), выполняемую капельным методом на стекле, с использованием диагностикума чумного иммуноглобулинового эритроцитарного, позволяющую через 5-7 мин с момента постановки реакции выявить наличие капсульного антигена в двухсуточной культуре, выращенной при 30 ^oC на плотной питательной среде. Однако для проведения идентификации по этому способу необходимо иметь культуру бактерий, что на практике не всегда возможно.

Известен способ экспрессной серодиагностики возбудителя чумы по обнаружению капсульного антигена при постановке реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с использованием диагностикума чумного иммуноглобулинового эритроцитарного. (Быкова О.И. Микроскопический учет РНГА в целях экспрессной серодиагностики некоторых особо опасных инфекций // Особо опасные и редко встречающиеся тропические инфекции: Тез. докл. науч. конф. Окт. 1980 г. Волгоград, 1980 г. С. 8-9). Реакцию ставили капельным методом на стекле со взвесями возбудителя чумы и учитывали результат в течение 5 мин с момента ее постановки с применением иммерсионной микроскопии по феномену образования агглютината. Титры РНГА при экспрессном учете, как правило, соответствуют титрам стандартной реакции (выполняемой объемным методом в лунках планшета) или незначительно уменьшаются в 2-4 раза. Однако результаты микроскопического учета РНГА в определенной степени зависят от особенностей изготовления и характеристики эритроцитарного диагностикума. Эти обстоятельства требуют предварительной проверки каждой серии диагностикума на возможность использования в экспрессном учете РНГА. Кроме того, этот способ не обеспечивает поэтапного контроля образования диагностических феноменов в опытных и контрольных пробах и достаточной степени достоверности полученных результатов, поскольку учет проводится только в первые 5 мин и только по феномену образования агглютината, и для подтверждения результатов (и специфичности, и чувствительности) необходима постановка РНГА объемным методом в лунках планшета для иммунологических реакций, в которой учет результатов производится по образованию феноменов "зонтик" "пуговка" и образование которых в РНГА, выполняемой капельным методом на стекле, невозможно.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является выбранный в качестве прототипа способ диагностики возбудителя чумы по обнаружению капсульного антигена в реакции агглютинации латекса (РАЛ) с использованием латексного антительного диагностикума (Рудник М.П. Гриднева Л. Г. Экспресс-диагностика возбудителя чумы с использованием реакции агглютинации латекса // Проблемы природно-очаговых и зоонозных инфекций в Сибири и на Дальнем Востоке: Тез. докл. к региональной науч.-практ. конф. (16-17 сент. 1993 г. ) Чита, 1993 г. С. 134-135.) Этот способ включает постановку двух отдельных серологических реакций, проводимых объемным и капельным методами, и осуществляется следующим образом. Серодиагностику капсульного антигена проводили путем постановки реакции агглютинации латекса (РА), осуществляемой по типу РПГА (РНГА) объемным методом в лунках планшета для иммунологических реакций, с микробными взвесями возбудителя чумы или с раствором антигена, с использованием диагностикума чумного иммуноглобулинового полиакролеинового. Учет результатов реакции производили визуально по образованию феномена "зонтиков" (при положительном результате) и "пуговок" (при отрицательном результате и в контроле диагностикума). Экспресс-диагностику проводили путем постановки РАЛ капельным методом на стекле, осуществляя учет результатов реакции через 4-15 мин по видимым хорошо сформированным агглютинатам с полным просветлением жидкости.

У прототипа и заявляемого способа имеются следующие сходные существенные признаки: проведение реакции непрямой суспензионной агглютинации, выполняемой объемным методом в лунках планшета для иммунологических реакций; использование диагностикума чумного иммуноглобулинового полиакролеинового; учет результатов по феномену образования агглютината через 4-15 мин с момента постановки реакции, что обеспечивает экспрессность способа; визуальный учет результатов по образованию феноменов "зонтики" "пуговки", что обеспечивает окончательную диагностику.

Недостатком прототипа является то, что проведение экспресс-диагностики капсульного антигена, осуществляемой путем постановки реакции капельным методом на стекле, и окончательной диагностики, осуществляемой путем постановки реакции объемным методом в лунках планшета, выполняют в двух отдельных серологических реакциях; недостаточная степень достоверности результатов, полученных в каждой из этих двух реакций, поскольку их учет производится также раздельно и без поэтапного контроля диагностических феноменов в опытных и контрольных пробах: учет результатов реакции на стекле производится только по образованию феномена агглютината, так как образование феноменов "зонтики" "пуговки" в этой реакции невозможно; а учет результатов реакции в лунках планшета производится только по образованию феноменов "зонтики" "пуговки", формирование которых происходит только через 90-120 мин. Кроме того, учет результатов реакции, выполняемой капельным методом на стекле, возможен только в течение 4-15 мин с момента ее постановки, поскольку через 30 мин появляются спонтанные агглютинаты в отрицательных контролях. Помимо этого, постановка серологической реакции капельным методом на стекле сопряжена с рядом усложнений и неудобств: необходимость предварительного отдельного проведения раститровки исследуемого материала, возможность растекания капель по поверхности стекла и смешивания с соседними каплями, что может приводить к искажению результата и не обеспечивает стандартные условия исследований.

Целью изобретения является обеспечение возможности проведения экспрессной и окончательной диагностики капсульного антигена, поэтапного контроля диагностических феноменов, повышение степени достоверности результатов реакции при высокой демонстративности диагностических феноменов.

Для достижения поставленной цели заявляемый способ включает проведение реакции непрямой суспензионной агглютинации (РНСА) объемным методом в лунках планшета с использованием диагностикума чумного иммуноглобулинового полиакролеинового, осуществление поэтапного контроля диагностических феноменов в опытных и контрольных пробах, последовательный учет результатов в одних и тех же лунках планшета через 4-15 мин и 30-45 мин с момента постановки реакции по образованию феномена агглютината, регистрируемого в проходящем свете микроскопа при малом увеличении (6-20^х) (при отрицательном результате и в контроле диагностикума гомогенная взвесь и равномерный осадок частиц диагностикума), а через 90-120 мин визуально по образованию феномена "зонтиков" (при отрицательном результате и в контроле диагностикума - "пуговки").

По отношению к прототипу у заявляемого способа имеются следующие отличительные признаки: проведение экспрессной и окончательной серодиагностики капсульного антигена в одной реакции, выполняемой объемным методом; осуществление поэтапного контроля диагностических феноменов в опытных и контрольных пробах с последовательным учетом результатов реакции в одних и тех же лунках планшета в проходящем свете микроскопа при малом увеличении (6-20 ^х) через 4-15 мин и 30-45 мин по образованию феномена агглютината, что обеспечивает возможность осуществления экспресс-диагностики и высокую демонстративность феноменов; осуществление учета результатов реакции в тех же лунках планшета с опытными и контрольными пробами через 90-120 мин по образованию феноменов "зонтиков" "пуговок", что обеспечивает окончательную диагностику капсульного антигена и в сопоставлении с поэтапным контролем и учетом ранее полученных результатов подтверждает достоверность их при высокой демонстративности диагностических феноменов.

Таким образом, между совокупностью общих и отличительных признаков и целью изобретения прослеживается причинно-следственная связь.

В табл. 1 приведены сравнительные характеристики демонстративности диагностических феноменов в РНСА и РНГА, выполняемых объемным методом в лунках планшета для иммунологических реакций, в зависимости от используемого диагностикума. В табл. 2 представлена возможность осуществления цели изобретения по заявляемому способу, по способу с использованием эритроцитарного диагностикума и способу-прототипу.

Пример 1. В U-образные лунки (вместимостью 0,2 мл каждая) планшета для иммунологических реакций вносят по 0,05 мл стабилизатора реакции, в первую лунку титратором добавляют 0,05 мл исследуемого материала (взвесь бактерий, суспензия внутренних органов животного и др.) и делают последовательные двукратные разведения переносом 0,05 мл смеси из первой лунки в последующие, включая предпоследнюю лунку, из которой лишние 0,05 мл удаляют. Реакцию сопровождают контролем устойчивости диагностикума в стабилизаторе реакции (последняя лунка). Затем во все лунки с опытными и контрольной пробами вносят по 0,025 мл (1 капля) 0,2-й взвеси диагностикума чумного иммуноглобулинового полиакролеинового, содержимое лунок перемешивают покачиванием и легким встряхиванием планшеты, которую устанавливают на предметный столик микроскопа (МБС-9, МБР-1). Поэтапный контроль и последовательный учет результатов реакции осуществляют в проходящем свете при малом увеличении (6-20 ^х). Через 5 мин в лунках с опытными пробами при положительном результате наблюдают образование четких агглютинатов по краям лунок с просветлением жидкости. В лунке с контрольной пробой и при отрицательном результате частицы диагностикума находятся в гомогенном взвешенном состоянии и частично выпадают на дно лунки в виде равномерного осадка без образования каких-либо агглютинатов. Через 30 мин в лунках с опытными пробами при положительном результате наблюдают наличие четких агглютинатов, покрывающих всю сферическую поверхность дна лунки с полным просветлением жидкости. В лунке с контрольной пробой и при отрицательном результате наблюдают выпадение частиц диагностикума в виде равномерного осадка, занимающего 2/3 поверхности дна лунки, без образования каких-либо спонтанных агглютинатов. Затем планшету оставляют при комнатной температуре, а через 90 мин визуально учитывают результат реакции по образованию феноменов "зонтиков" "пуговок". В лунках с опытными пробами при положительном результате наблюдают наличие равномерного осадка в виде "зонтика", занимающего почти всю поверхность дна лунки. В лунке с контрольной пробой и при отрицательном результате наблюдают наличие осадка частиц диагностикума в виде компактной "пуговки" в центре дна лунки, имеющей четкие ровный края. За титр реакции принимают наибольшее разведение исследуемого материала в той лунке опытной пробы, в которой "зонтик" занимает не менее 2/3 сферической поверхности дна.

Пример 2. В U-образные лунки (вместимостью 2 мл каждая) планшета для иммунологических реакций вносят по 0,2 мл стабилизатора реакции, в первую лунку титратором добавляют 0,2 мл исследуемого материала (взвесь бактерий, суспензия внутренних органов животного и др.) и делают последовательные двукратные разведения переносом 0,2 мл смеси из первой лунки в последующие, включая предпоследнюю лунку, из которой лишние 0,2 мл удаляют. Реакцию сопровождают контролем устойчивости диагностикума в стабилизаторе реакции (последняя лунка). Затем во все лунки с опытными и контрольной пробой вносят по 0,025 мл (1 капля) 0,6-й взвеси диагностикума чумного иммуноглобулинового полиакролеинового, содержимое лунок перемешивают покачиванием и легким встряхиванием планшеты, которую устанавливают на предметный столик микроскопа. Поэтапный контроль и последовательный учет результатов реакции осуществляют в проходящем свете при малом увеличении. Через 10 мин в лунках с опытными пробами при положительном результате наблюдают наличие четких агглютинатов с просветлением жидкости. В лунке с контрольной пробой и при отрицательном результате частицы диагностикума находятся в гомогенном взвешенном состоянии и частично выпадают на дно лунки в виде равномерного осадка без образования каких-либо агглютинатов. Через 40 мин в лунках с опытными пробами при положительном результате наблюдают наличие четких агглютинатов, покрывающих всю сферическую поверхность дна лунки с полным просветлением жидкости. В лунке с контрольной пробой и при отрицательном результате наблюдают выпадение частиц диагностикума в виде равномерного осадка, занимающего 1/2 поверхности дна лунки, без образования каких-либо спонтанных агглютинатов. Через 100 мин визуально учитывают результат реакции по образованию феноменов "зонтиков" - "пуговок". В лунках с опытными пробами при положительном результате наблюдают наличие равномерного осадка в виде "зонтика", занимающего почти всю поверхность дна лунки. В лунке с контрольной пробой и при отрицательном результате наблюдают наличие осадка частиц диагностикума в центре дна лунки в виде компактной "пуговки", имеющей четкие ровные края. За титр реакции принимают наибольшее разведение исследуемого материала в той лунке опытной пробы, в которой "зонтик" занимает не менее 2/3 сферической поверхности дна.

Пример 3. В U-образные лунки (вместимостью 0,2 мл каждая) планшета для иммунологических реакций вносят по 0,05 мл стабилизатора реакции, в первую лунку титратором добавляют 0,05 мл исследуемого материала (взвесь бактерий, суспензия внутренних органов животного и др.) и делают последовательные двукратные разведения переносом 0,05 мл смеси из первой лунки в последующие, включая предпоследнюю лунку, из которой лишние 0,05 мл удаляют. Реакцию сопровождают контролем устойчивости диагностикума в стабилизаторе реакции (последняя лунка). Затем во все лунки с опытными и контрольной пробами вносят по 0,025 мл (1 капля) 0,1-й взвеси диагностикума чумного иммуноглобулинового полиакролеинового, содержимое лунок перемешивают покачиванием и легким встряхиванием планшеты, которую устанавливают на предметный столик микроскопа. Поэтапный контроль и последовательный учет результатов реакции осуществляют в проходящем свете при малом увеличении. Через 15 мин в лунках с опытными пробами при положительном результате наблюдают наличие четких агглютинатов с просветлением жидкости. В лунке с контрольной пробой и при отрицательном результате частицы диагностикума находятся в гомогенном взвешенном состоянии и частично выпадают на дно лунки в виде равномерного осадка без образования каких-либо агглютинатов. Через 45 мин в лунках с опытными пробами при положительном результате наблюдают наличие четких агглютинатов, покрывающих всю сферическую поверхность дна лунки с полным просветлением жидкости. В лунке с контрольной пробой и при отрицательном результате наблюдают выпадение частиц диагностикума в виде равномерного осадка, занимающего 1/2 поверхности дна лунки, без образования каких-либо спонтанных агглютинатов. Через 120 мин визуально учитывают результат реакции по образованию феноменов "зонтиков" - "пуговок". В лунках с опытными пробами при положительном результате наблюдают наличие равномерного осадка в виде "зонтика", занимающего почти всю поверхность дна лунки. В лунке с контрольной пробой и при отрицательном результате наблюдают наличие осадка частиц диагностикума в центре дна лунки в виде компактной "пуговки", имеющей четкие ровные края. За титр реакции принимают наибольшее разведение исследуемого материала в той лунке опытной пробы, в которой "зонтик" занимает не менее 2/3 сферической поверхности дна.

Как показали экспериментальные исследования, граничные значения заявляемых параметров необходимы и достаточны для достижения поставленной цели.

Использование заявляемого изобретения обеспечивает возможность проведения экспрессной и окончательной серодиагностики капсульного антигена чумного микроба в реакции непрямой суспензионной агглютинации, выполняемой объемным методом, с повышением степени достоверности результатов реакции за счет поэтапного контроля диагностических феноменов в опытных и контрольных пробах с последовательным учетом результатов через 4-15 мин, 30-45 мин и 90-120 мин.

Использование: иммунология, в частности, серодиагностика возбудителя чумы. Сущность изобретения: предлагается сочетанное осуществление экспрессной и окончательной серодиагностики капсульного антигена в реакции непрямой суспензионной агглютинации, выполняемой объемным методом, с использованием диагностикума чумного иммуноглобулинового полиакролеинового, с проведением поэтапного контроля диагностических феноменов в опытных и контрольных пробах и последовательным учетом результатов реакции - через 4-15 мин и 30-45 мин в проходящем свете микроскопа при малом увеличении (6-20х) по образованию феномена агглютината, а через 90-120 мин - по образованию феноменов "зонтик"-"пуговка". 2 табл.

Способ серодиагностики капсульного антигена чумного микроба, включающий проведение реакции непрямой суспензионной агглютинации с использованием диагностикума чумного иммуноглобулинового полиакролеинового, осуществление экспресс-диагностики с учетом результатов через 4 15 мин с момента постановки реакции по образованию феномена агглютината и окончательной серодиагностики в лунках планшета, выполняемой объемным методом, с визуальным учетом результатов через 90 120 мин по образованию феноменов зонтик - пуговка, отличающийся тем, что экспресс-диагностику и окончательную серодиагностику осуществляют в одних и тех же лунках планшета и дополнительно проводят промежуточный учет результатов реакции через 30 45 мин в проходящем свете микроскопа при малом увеличении (6 20х) по образованию феномена агглютината.