СПОСОБ УСКОРЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУЛЕНТНОСТИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ ЭЛЬТОР, ВЫДЕЛЯЕМЫХ ВО ВРЕМЯ ВСПЫШЕК ХОЛЕРЫ ОТ ЛЮДЕЙ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 C12N7/00 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности, к определению вирулентности холерных вибрионов эльтор.

Известен способ определения вирулентности холерного вибриона эльтор, основанный на специфичности холерных фагов в совокупности с гемолитической активностью с выделением чистой культуры и ее полной идентификацией (Инструктивно-методические указания по лабораторной диагностике холеры, Москва, 1984, с.40). Подозрительные колонии, выросшие на агаровых пластинках при засеве их нативным материалом или после предварительного подращивания нативного материала на пептонной воде, проверяют на наличие цитохромоксидазы. При положительном ответе ставят ориентировочную реакцию агглютинации с О-холерной сывороткой в разведении 1:50-1:100. Образование агглютинатов и просветление жидкости в совокупности с рядом других признаков, таких как морфология колоний и подвижность микробных клеток, дают основания к выдаче предварительного положительного ответа на наличие в материале холерного вибриона 01 группы на 14-24 ч исследования. Заключение с вирулентности выделяемых микроорганизмов на этих этапах бактериологического анализа не дается, т. е. следуя классической схеме далее проводят выделение чистой культуры на плотных питательных средах с последующей идентификацией и определением вирулентности на основании постановки пробы с холерными диагностическими фагами (ХДФ 3,4,5) и гемолитического теста, на что затрачивается не менее 60 ч с момента начала исследования.

Недостатком данного способа является длительность получения результатов, что влечет за собой несвоевременность проведения профилактических и противоэпидемических мероприятий, объем которых определяется степенью вирулентности выделенных штампов: обычный бактериологический анализ на холеру предусматривает выдачу окончательного ответа о результатах идентификации выделенных культур спустя 48 ч, определение их вирулентности происходит не ранее 60 ч с начала исследования.

Наиболее близким к предполагаемому изобретению является способ определения вирулентности путем посева нативного материала на пластинки агара и в пептонную воду, инкубированием и последующим отбором подозрительных по морфологическим признакам колоний, которые дают положительную реакцию на наличие цитохромоксидазы и агглютинирующая 0-холерной сывороткой в ориентировочной реакции. Эти колонии отсевают на агаровые пластинки для получения чистой культуры, инкубируют в течение 18-24 ч, затем, полученной микробной массой засевают питательные среды для идентификации выделенных микроорганизмов. Инкубируют по крайней мере еще 18-24 ч. Учитывают результаты и в случаях, когда выделенные микроорганизмы дают типичное для холерных вибрионов поведение, из них готовят взвесь в мясопептонном бульоне. После подращивания в течение 3-4 ч с частью взвеси ставят пробу с фагами, которую учитывают через 18-20 ч. Продолжая подращивание основной части бактериальной взвеси в течение суток ее затем используют в гемолитическом тесте (Инструктивно-методические указания по лабораторной диагностике холеры. Москва, 1984, 39-40).

Недостатком данного способа является значительные затраты времени, приводящие к несвоевременности проведения профилактических и противоэпидемических мероприятий, направленных на локализацию очага холеры, изоляцию и лечение больных, пресечение путей передачи. Это в свою очередь приводит к большому числу зараженных людей из-за высокой эпидемичности холеры.

Целью предлагаемого изобретения является сокращение сроков определения вирулентности холерных вибрионов эльтор, которые выделяются во время вспышки холеры от людей, чем определяется объем дорогостоящих мероприятий, направленных на ограничение распространения инфекции.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что нативный материал засевают на пластинки агара и в пептонную воду с последующим подращиванием и высевом на пластинки агара, инкубируют и отбирают подозрительные по морфологическим признакам колонии, оксидазоположительные и дающие положительную реакцию агглютинации на стекле с 0-холерной сывороткой. Из них готовят взвесь микроорганизмов в мясопептонном бульоне. Отличия заключаются в том, что в процессе приготовления бактериальной взвеси в мясопептонный бульон добавляют 0,005-0,01% додецилсульфата натрия. Пробу с фагами и гемолитический тест ставят тотчас из приготовленной взвеси.

Существенные признаки предлагаемого изобретения, включенные в формулу изобретения, позволили определить вирулентность холерных вибрионов практически в течение первых суток с момента поступления материала на исследование. Возможность раннего определения вирулентности холерных вибрионов эльтор, выделяемых во время вспышек холеры от людей, возникла в результате выявленных нами новых свойств влияния, а именно влияние додецилсульфата натрия на микробные клетки холерных вибрионов эльтор, в результате чего увеличивается сродство холерного фага к своему хозяину холерному вибриону. Это явление можно объяснить, вероятно, процессом адсорбции молекул додецилсульфата натрия за счет поверхностно-активных свойств на холерный вибрион, причем в этих концентрациях не происходит дезорганизация клеточной стенки. Сорбция молекул детергента приводит к изменению поверхностного заряда клетки, что по всей видимости, облегчает фиксацию фаговых частиц на клеточной поверхности. Этот эффект позволяет избежать этапа выделения чистой культуры и осуществить постановку пробы с фагами и гемолитического теста сразу же с получением микробной взвеси.

Способ осуществляется следующим образом. Нативный материал, подозрительный на зараженность холерными вибрионами, засевают в 50 мл 1%-ной пептонной воды и одновременно на пластинку питательного агара. Инкубируют при 37^oC. Через 4-6 ч делают высев из пробирки с пептонной водой на пластинку питательного агара, которую выдерживают в термостате при 37^oC. Через 14-16 ч с момента посева просматривают пластинки агара на наличие колоний, характерных для холерного вибриона: круглой формы, прозрачные, влажные, с ровным краем, серо-голубого цвета. Эти колонии агглютинируют на стекле с 0-холерной сывороткой, взятой в разведении 1:50-1:100. При наличии агглютинатов и просветления жидкости результат оценивается как положительный. В таком случае из агглютинирующихся колоний готовят взвесь в 2-3 мл мясопептонного бульона (pH 7,2-7,4), содержащего 0,005-0,01% додецилсульфата натрия, до образования заметной мути. Этапы выделения культуры в чистом виде на пластинке агара и предварительного подращивания опускаются, что позволяет сразу приступить к определению чувствительности к холерным фагам и гемолитической активности.

Проба с фагами осуществляется следующим образом. В чашки Петри разливают 1,5%-ный питательный агар (pH 7,2-7,4), после застывания его подсушивают при 37^oC в течение 30 мин, после чего дно чашек делят на секторы по количеству 10-кратных разведений фага. В пробирку с 3 мл 0,7%-ного питательного агара, расплавленного и охлажденного до 45^oC, добавляют 0,1 мл взвеси микробов в мясопетонном бульоне с додецилсульфатом натрия (0,005-0,01%). Тщательно перемешивают и выливают в чашки Петри на слои застывшего агара. Чашки оставляют при комнатной температуре с приоткрытыми крышками на 30 мин. В центре секторов наносят стандартной петлей по капле фагов в обозначенных разведениях. После подсыхания чашки Петри в перевернутом виде помещают в термостат при 37^oC. Результаты начинают учитывать через 2-4 ч. Наличие лизиса в виде одного "стерильного" пятна или группы мелких негативных колоний оценивается как положительный результат на наличие холерного вибриона. В этой пробе используются холерные фаги классического и эльтор биоваров. Наличие лизиса в конечном разведении фагов позволяет судить о принадлежности выделенных микробов не только к группе холерных вибрионов, но определить их биологический вариант классическому или эльтор. Наряду с этим определяют вирулентность холерных вибрионов при помощи холерных диагностических фагов (ХДФ) 3,4,5.

Гемолитический тест осуществляется следующим образом. Из оставшегося бульона с додецилсульфатом натрия забирают 1 мл и соединяют с таким же количеством 1%-ной взвеси эритроцитов барана. Эту смесь выдерживают при 37^oC в течение 2 ч. На основании результатов пробы с ХЛФ 3,4,5 и гемолитической активности по специальной схеме определяется вирулентность вибрионов эльтор, находящихся в материале, без выделения чистой культуры. Предварительное заключение о вирулентности выдавалось в этом случае лабораторией на 18-20 ч с момента поступления материала на исследование. Параллельно проводится развернутый бактериологический анализ, рекомендованный инструктивными материалами.

Пример 1. Испражнения больного с подозрением на холеру засевали в 50 мл 1% -ной пептонной воды и на пластинку агара, выдерживали в термостате при 37^oC. Через 5 ч из пептонной воды делали высев на пластинку агара, которую инкубировали при 37^oC в термостате. Через 15 ч с момента посева просматривали пластинки агара на наличие гладких прозрачных бесцветных круглых колоний, подозрительных на холерные. Эти колонии агглютинировали на стекле в капле холерной 0- сыворотки в разведении 1:100. Из агглютинирующихся колоний готовили взвесь в мясопептонном бульоне, содержащем 0,005% додецилсульфата натрия. Бактериальную массу добавляли в бульон до видимой мути, после чего с этой взвесью сразу ставили пробу с фагами и гемолитический тест, т.е. в предварительно разлитые и подсушенные чашки с 1,5%-ным питательным агаром наслаивали 3 мл 0.7%-ного полужидкого агара, остуженного до 45^oC, в который заранее внесли 0,1 мл микробной взвеси в мясопептонном бульоне с 0,005% додецилсульфата натрия. Чашки подсушивали в течение получаса для застывания слоя полужидкого агара, а затем бактериологической петлей наносили капли фагов в обозначенных разведениях. После высыхания капель чашки переносили в термостат при 37^o C. Результаты начинали учитывать через 2 ч, когда появлялись на фоне сплошного микробного роста стерильные пятна, что говорит о наличии в испражнениях холерных вибрионов. Мы отмечали лизис культуры фагом эльтор в конечном разведении и ХДФ 4 и 5. Из оставшегося бульона с додецилсульфатом натрия и суспензией бактерий отбирали 1 мл и соединяли с таким же объемом 1%-ной взвеси эритроцитов барана. Эту смесь выдерживали при 37^o C, учет производили через 2 часа. Лизис эритроцитов отсутствовал, они осели на дно пробирки, столбик бульона над ними бесцветен. Следовательно, штамм гем отрицателен. На основании лизиса эльтор с раннее произведенной реакцией агглютинации на стекле с О-холерной сывороткой можно предполагать, что в испражнениях находится возбудитель холеры эльтор. Лизис ХДФ 4,5 в сочетании с отсутствием гемолиза позволил выделяемую культуру отнести к вирулентным согласно схеме дифференциации вибрионов эльтор и гемолитической активности (Инструктивно-методические указания по лабораторной диагностике холеры. М, 1984, с. 47).

Пример 2. Рвотные массы больного с подозрением на холеру засевали в 50 мл 1%-ной пептонной воды и на пластинку агара, выдерживали в термостате при 37^oC. Через 5 ч из флакона с пептонной водой делали высев на пластинки агара, которые держали в термостате при 37^oC. Через 14 ч с момента высева просматривали пластинки на наличие подозрительных колоний, при наличии их агглютинируют в холерной О сыворотке (разведение 1:100), при положительной реакции агглютинации колонии суспензировали в 2-3 мл мясопептонного бульона, содержащего 0,0075% додецилсульфата натрия, до заметной мути. Непосредственно после этого с частью бульона (0,1 мл) ставили пробу с фагами эльтор и ХДФ 3,4,5. Для чего на пластинку уже разлитого и подсушенного питательного агара наслаивали полужидкий 0,7% агар, остуженный до 45^oC, в который вносили бульонную культуру с додецилсульфатом натрия. Спустя некоторое время, когда верхний слой застынет, на него наносили капли фагов с, эльтор, ХДФ 3,4,5 в нескольких разведениях. После чего чашки слегка подсушив, помещали в термостат при 37^oC. Учет результатов проводили спустя 2 ч по отсутствию роста культуры в местах наноса капель фага, что свидетельствует о специфическом лизисе культуры под действием фагов эльтор и ХДФ 3,4,5. Затем 1 мл микробной взвеси в бульоне с додецилсульфатом натрия соединяли в пробирке с 1 мл взвеси эритроцитов барана (1%), выдерживали при 37^oC в течение 2 ч. Наступивший спустя это время лизис эритроцитов отмечали по окрашиванию бульона в красный цвет ("лаковая" кровь) и отсутствию осевших эритроцитов. Агглютинация на стекле и лизис фагом эльтор подтверждает принадлежность к холерным вибрионам, отсутствие гемолиза эритроцитов барана и лизис культуры под действием фагов ХДФ 3,4,5 позволяет отнести выделенную культуру к слабовирулентным согласно упомянутой выше схеме.

Пример 3. Испражнения больного с подозрением на холеру были засеяны во флакон с 50 мл пептонной воды и на пластинку питательного агара, инкубированы при 37^oC. Через 6 ч из флакона сделали высев на пластинку агара. Спустя 16 ч роста с пластинок агара производили отбор круглых сочных блестящих прозрачных колоний, подозрительных на отношение к холерным. Их агглютинировали с О-холерной и моноспецифическими (Огава и Инаба) сыворотками в разведении 1: 100. При агглютинации О-холерной и Инаба сыворотками колонии суспендировали в 2-3 мл мясопептонного бульона с 0,01% додецилсульфата натрия до образования заметной мути. Эту взвесь сразу же засевали в объеме 0,1 мл в 0,7% полужидкий агар, который наслаивали на пластинку предварительно разлитого агара. Подсушивали и наносили капли раститрованных фагов. После чего чашки помещали в термостат, спустя 2 ч учитывали образование негативных колоний при воздействии фагов эльтор и ХДФ 3,4,5. Параллельно с этим 1 мл микробной взвеси с додецилсульфатом натрия смешивали с таким же количеством 1% -ной взвеси эритроцитов барана инкубируем в течение 2 ч при 37^oC. Эритроциты спустя это время осели на дно пробирки, бульон не окрашен. Культура не обладает гемолитическими свойствами. На основании лизиса клеток фагами 3,4,5 и отрицательного гемолиза выделенная культура холерного вибриона согласно вышеупомянутой схемы является вирулентной.

Рекомендуемый нами способ ускоренного определения вирулентности холерных вибрионов эльтор был опробован во время вспышки холеры в г. Ставрополе (1990 г. ) при исследовании 7 тысяч анализов от людей, в результате чего выделено 144 штамма холерных вибрионов эльтор.

Использование: медицинская микробиология. Сущность изобретения: нативный материал высевают на пластинки питательного агара и в пептонную воду, инкубируют с последующим отбором подозрительных колоний по морфологическим признакам, наличию цитохромоксидазы и агглютинирующихся в ориентировочной реакции на стекле с О-холерной сывороткой, из которых готовят взвесь на мясопептонном бульоне и с ней ставят пробу с фагами и гемолитический тест. В процессе приготовления взвеси в мясопептонный бульон добавляют 0,05-0,01% додецилсульфата натрия, и реакцию с фагами и гемолитический тест проводят тотчас из приготовленной бактериальной взвеси. 1 табл.

Способ ускоренного определения вирулентности холерных вибрионов эльтор, выделяемых во время вспышек холеры от людей, путем посева нативного материала на пластинки питательного агара и в пептонную воду, инкубирования с последующим отбором подозрительных колоний по морфологическим признакам: наличию цитохромоксидазы и агглютинации в ориентировочной реакции на стекле с О-холерной сывороткой, приготовления из отобранных колоний взвеси на мясопептонном бульоне и постановку с ней пробы с фагами и гемолитического теста, отличающийся тем, что в процессе приготовления взвеси в мясопептонный бульон добавляют 0,005 0,01% додецилсульфата натрия и пробу с фагами и гемолитический тест проводят тотчас из приготовленной бактериальной взвеси.