Способ получения диагностической сыворотки против бруцелл в R-форме Российский патент 2024 года по МПК G01N33/53 A61K39/10 C12N1/20 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и иммунологии и может быть использовано в качестве контрольной бруцеллезной сыворотки при производстве тест-систем (наборов) для серологической диагностики бруцеллеза в разных модификациях реакции агглютинации (РА) при дифференциальной оценке гуморального ответа у животных, иммунизированных неагглютиногенными или слабоагглютиногенными вакцинами или инфицированных бруцеллами в R-форме, а также в качестве агглютинирующей сыворотки для идентификации выделенных культур бруцелл.

Бруцеллез относится к инфекционным заболеваниям животных, а также представляет большую опасность для людей, поэтому повышение качества диагностики и полная его ликвидация является актуальной задачей для ветеринарной и медицинской науки.

У бруцелл описаны явления диссоциации с образованием (R-; S-; L-) форм, обладающие различными культурально-морфологическими, антигенными, биологическими и другими свойствами [1, 2].

В настоящее время в лабораторной диагностике бруцеллеза широко применяют диагностические тест-системы, выявляющие антитела к бруцеллам в S-форме, поэтому c учетом изменчивости возбудителя остается актуальной разработка диагностических препаратов для выявления диссоциированных форм возбудителя с помощью иммунологических реакций [3].

Известен способ получения диагностической сыворотки против бруцелл в L-форме путем трансформации с помощью стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл вакцинного штамма B.abortus 19 (S-форма), стабилизации его на плотной питательной среде с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки, получение антигена из стабильного штамма B.abortus 19 в L-форме, инактивирование при температуре 85-90°С в течение 60 минут, трехкратную внутривенную гипериммунизацию кроликов в возрастающих дозах 60, 90, 120 млрд. м.к. [4].

При создании изобретения ставилась задача - разработать способ получения диагностической сыворотки, пригодной для выявления и идентификации бруцелл в R-форме, экологически безопасный, обеспечивающий универсальность применения, не требующий дополнительных экономических затрат, повышающий количественные и качественные показатели готовой продукции.

Наиболее близким является способ получения R-бруцеллезной сыворотки на кроликах, включающий однократное подкожное введение смеси антигена (100 млн. КОЕ/мл инактивированной культуры B.abortus 16/4) с адьювантом MONTANIDE^TMISA 61 VG, пробное крововзятие на 16-20 день и с 21 по 35 день после гипериммунизации – трех-четырех кратное взятие крови от каждого кролика или тотальное обескровливание, получение сыворотки, консервацию сыворотки мертиолатом натрия [5].

Недостатками этого способа являются: использование в качестве адьюванта импортного препарата MONTANIDE^TMISA 61 VG, производитель – фирма «SEPPIC», Франция, применение консерванта, представляющего собой химическое соединение, возможность использования конечного продукта только в бактериологической диагностике.

Техническим результатом предлагаемого способа получения диагностической сыворотки против бруцелл в R-форме является получение препарата из штамма B.abortus 16/4 со стабильными антигенными свойствами, повышение экономичности в связи с отсутствием дополнительных дорогостоящих зарубежных компонентов, экологическая безопасность, достигаемая за счет применения инактивированной биомассы и стерилизации полученного препарата механическим способом без использования химических веществ, увеличение объема готового продукта за счет возможности получения высокоактивной бруцеллезной сыворотки уже с 4 суток после окончания схемы иммунизации, универсальность применения в нескольких модификациях реакции агглютинации при оценке гуморального ответа и изучении антигенных свойств выделенных штаммов при бактериологической диагностике биоматериала от животных, иммунизированных неагглютиногенными или слабоагглютиногенными вакцинами или инфицированных бруцеллами в R-форме.

В качестве животных-продуцентов использовали кроликов.

Техническое решение достигается тем, что способ получения диагностической сыворотки против бруцелл в R-форме на кроликах включает получение двухсуточной культуры из штамма B.abortus 16/4 в R-форме со стабильными антигенными свойствами, наращивание бактериальной массы на матровых колбах с плотной селективной питательной средой и приготовление суспензии, которую инактивируют при температуре 80°С в течение 60 минут, трехкратно отмывают от среды в асептических условиях, путем добавления стерильного физиологического раствора и центрифугирования при 3000 об/мин 15-20 минут. Готовый препарат инокулируют внутривенно животным-продуцентам трехкратно с интервалом 72 часа в возрастающей дозе соответственно 60, 90, 120 млрд. КОЕ/мл. Получение гипериммунной сыворотки проводят с 4 суток после последней инокуляции, из расчета 16-20 мл на 1 кг живой массы кролика. Производственное кровопускание (тотальное обескровливание) оптимально проводить с 15 по 42 сутки после окончания схемы иммунизации.

После крововзятия ёмкости с кровью отстаивают в термостате при 37°С в течение 3-4 часов для отделения сыворотки, затем помещают в холодильник при 2-8°С для отстаивания. Каждую серию полученной сыворотки подвергают ультрафильтрации с помощью фильтрующей системы с диаметром пор не более 0,22 мкм. Затем сыворотку проверяют на стерильность, активность и специфичность.

Она должна быть стерильной, не агглютинировать в реакции РА с гетерологичными антигенами из бруцелл в S-форме и положительно реагировать с гомологичными R-антигенами в титрах пробирочной РА – не ниже 1:80, пластинчатой – 1:20, с нативными R-культурами – не ниже 1:80.

Возможность практического осуществления предлагаемого изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения способа с использованием полной совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Активность каждой серии полученной диагностической R-сыворотки проверяли в пробирочной реакции агглютинации с гетерологичным антигеном (единый антиген для РА и РСК «Тест-система для диагностики бруцеллеза в РА, РСК, РДСК» ФКП «Щелковский биокомбинат»).

Специфичность каждой серии полученной диагностической R-сыворотки проверяли в пробирочной и пластинчатой РА с антигеном из R-штаммов бруцелл, используя «Набор для дифференциальной серологической диагностики бруцеллеза и контроля иммунного ответа крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма B.abortus 82». Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Определение активности и специфичности полученной диагностической R-сыворотки кроликов

№ серии Срок исследования (сутки) Результаты исследования (средние титры по группе) РА пробирочная РА пластинчатая единый
10-640 (МЕ) R
1:640 R
1:80 1 4 сутки - 1:160 1:80 2 7 сутки - 1:160 1:90 3 15 сутки - 1:640 1:60 4 21 сутки - 1:640 1:60 5 28 сутки - 1:560 1:60 6 35 сутки - 1:400 1:60 7 42 сутки - 1:400 1:60 8 49 сутки - 1:240 1:60

Наибольшую активность полученной R-сыворотки по всем серологическим реакциям с R-антигеном отмечали на 15-21 сутки с диагностическим титром (средний по группе) в РА пробирочной – 1:640, РА пластинчатой – 1:60.

При изучении специфичности полученных серий диагностической R-сыворотки в серологических реакциях с S-антигеном, во всех случаях отмечали отрицательный результат.

Пример 2. Эффективность использования полученных серий диагностической сыворотки для индикации и дифференциации типичных и измененных форм бруцелл изучали с использованием нативных культур вакцинных штаммов с известными антигенными свойствами - B.abortus 19 c.6 (S-форма), В.abortus 16/4 (R-форма), B.abortus 82 с.3 (SR-форма). Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Определение активности и специфичности диагностической R-сыворотки в пластинчатой РА с нативными культурами вакцинных штаммов бруцелл в (S-), (R-) и (SR-) форме

№ серии Срок исследования (сутки) Результаты исследования (средние титры по группе) В.abortus 19 c.6
(S-форма)
1:10 – 1:80 В.abortus16/4
(R-форма)
1:10 – 1:80 В.abortus 82 с.3
(SR-форма)
1:10 – 1:80 1 4 сутки - 1:80 1:20 2 7 сутки - 1:80 1:40 3 15 сутки - 1:80 1:35 4 21 сутки - 1:80 1:37,5 5 28 сутки - 1:80 1:37,5 6 35 сутки - 1:80 1:27,5 7 42 сутки - 1:80 1:27,5 8 49 сутки - 1:80 1:27,5

Во всех сериях диагностической сыворотки наблюдалось отсутствие агглютинации с B.abortus 19 c.6 в S-форме, тогда как, в реакции с В.abortus16/4 в R-форме во всех случаях отмечалось образование стойкого мелкого агглютината в разведениях сыворотки 1:80 на «4 креста». В реакциях с B.abortus 82 с.3 (SR-форма) также во всех случаях отмечалось наличие мелкого агглютината в разведениях сыворотки 1:20-1:80.

Пример 3. Для определения эффективности использования диагностической R-сыворотки при исследовании культур, выделенных от разных видов животных, изучили штаммы бруцелл как референтные, так и выделенные от разных видов животных. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 – Определение активности и специфичности диагностической R-сыворотки в РА на стекле с нативными культурами бруцелл, референтных штаммов и выделенных от разных видов животных

№ п/п Наименование штамма Морфология колоний Основной хозяин
(вид животного) Результат пластинчатой реакции агглютинации на стекле Разведение диагностической
R-сыворотки 1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 Референтные штаммы 1 В.abortus 544 S КРС и другие представители рода Bovidae - - - - - 2 B.melitensis 16M S Овцы, козы - - - - - 3 B.suis 1330 S свиньи - - - - - 4 B.ovis 63/290 R овцы # # # # # 5 B.canis 6/66 R собаки # # # # # Эпизоотические штаммы 6 В.abortus 1-15 S КРС - - - - - 7 В.abortus 2-15 S КРС - - - - - 8 В.abortus 3-15 S КРС - - - - - 9 В.abortus 4-15 S КРС - - - - - 10 В.abortus 9-71 S R КРС # # - - - 11 В.abortus 120-77 S R КРС # # # - - 12 В.abortus 111-89 S R КРС # # # # - 13 В.abortus 147-89 S R КРС # # # - - 14 B.ovis 246-90 R овцы # # # # # 15 B.ovis 2000-90 R овцы # # # # # 16 B.ovis 11-90 R овцы # # # # # 17 B.canis 1-06 R собаки # # # # # 18 B.canis 1-07 R собаки # # # # # 19 B.canis 1-08 R собаки # # # # # 20 B.canis 1-22 R собаки # # # # #

При определении агглютинирующих свойств исследуемых культур бруцелл с ранее изученными антигенными свойствами в комплексе культурально-морфологических, биохимических и других тестов, отмечена специфичность пластинчатой реакции агглютинации и соответствие агглютинирующих свойств штаммов морфологическим характеристикам.

Таким образом, диагностическая сыворотка против бруцелл в R-форме обладает строгой специфичностью и высокой активностью. Полученный препарат может использоваться как в серологических исследованиях в разных модификациях РА, при определения гуморального иммунного ответа на сенсибилизацию бруцеллами в R и SR-форме, так и для дифференциации культур бруцелл, выделенных при бактериологическом исследовании не зависимо от вида животных.

Изобретение может быть использовано в научно-исследовательских и производственных лабораториях, занимающихся проблемами бруцеллеза животных.

Литература

1. Дегтяренко Л., Карлова М.Ю., Каликин И.Н. Диагностическая эффективность R-бруцеллезных антигенов при бруцеллезе крупного рогатого скота. Ветеринария сельскохозяйственных животных. 2015. №11. С. 12-19;

2. Косарев М.А., Фомин А.М., Сафина Г.М., Григорьева С.А., Тухватуллина Л.А. Изучение культурально-морфологических свойств бруцелл вида abortus, находящихся в различной степени диссоциации. Ветеринарный врач. 2018. № 4. С. 14-18;

3. Наставление по диагностике бруцеллеза животных. Утв.Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ 29.09.2003 №13-5-02/0850;

4. Способ получения диагностической сыворотки против бруцелл в L-форме. Ощепков В.Г., Гордиенко Л.Н., Братцев А.Ю. Патент RU2268748 С2, 27.01.2006. Бюл.№03. Заявка №2003121773/13 от 15.07.2003;

5. Способ получения R-бруцеллёзной сыворотки на кроликах. Аракелян П.К., Разницына Г.В., Янченко Т.А., Димов С.К., Димова А.С. Патент RU 2659948 C1, 04.07.2018. Бюл.№9. Заявка № 2017108572 от 14.03.2017.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и иммунологии. Предложен способ получения диагностической сыворотки против бруцелл в R-форме, включающий получение двухсуточной культуры из штамма B.abortus 16/4 в R-форме со стабильными антигенными свойствами, наращивание бактериальной массы и приготовление суспензии без химического воздействия, путем инактивации при 80°С 60 мин и трехкратном отмывании от среды стерильным физиологическим раствором в асептических условиях. Готовый препарат инокулируют животным-продуцентам внутривенно трехкратно с интервалом 72 ч в возрастающих дозах. Получение гипериммунной сыворотки проводят с 4 суток после последней инокуляции, а производственное кровопускание (тотальное обескровливание) проводят с 15 по 42 сутки после окончания схемы иммунизации. После крововзятия емкости с кровью отстаивают в термостате при 37°С в течение 3-4 ч для отделения сыворотки, затем помещают в холодильник при 2-8°С для отстаивания. Каждую серию полученной сыворотки подвергают ультрафильтрации. Сыворотку проверяют на стерильность, активность и специфичность. Техническим результатом является эпидемическая безопасность, универсальность применения в РА нескольких модификаций в качестве контроля при оценке гуморального ответа и может использоваться для определения антигенных свойств выделенных штаммов при бактериологической диагностике биоматериала от животных, иммунизированных неагглютиногенными или слабоагглютиногенными вакцинами или инфицированных бруцеллами в R-форме. 3 табл., 2 пр.

Способ получения диагностической сыворотки против бруцелл в R-форме, включающий получение культуры из R-штамма B.abortus 16/4 со стабильными антигенными свойствами, подготовку бактериальной суспензии, гипериммунизацию, крововзятие, получение сыворотки и проверку сыворотки на стерильность, активность и специфичность, отличающийся тем, что иммунизацию проводят внутривенно трехкратно в возрастающих дозах дискретно по времени, а суспензию для инъекции готовят без химического воздействия, путем инактивации при 80°С 60 мин и трехкратном отмывании от среды стерильным физиологическим раствором в асептических условиях, получение сыворотки проводят с 4 суток после последней инокуляции, обескровливают с 15 по 42 сутки после окончания схемы иммунизации, полученную сыворотку подвергают ультрафильтрации.