СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВТОРИЧНЫХ ИММУНОДЕФИЦИТОВ У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2006 года по МПК G01N33/53 G01N33/49 

Изобретение относится к области ветеринарии, касается способа диагностики вторичных иммунодефицитов у крупного рогатого скота.

Термином иммунодефициты обозначают нарушения нормального иммунологического статуса организма, которые обусловлены дефектом одного или нескольких механизмов иммунного ответа /1/.

В зависимости от того, какого компонента иммунной системы не хватает или он слабо активен, иммунные дефициты делят на следующие виды: недостаточность клеточного иммунитета (Т-системы лимфоцитов); недостаточность гуморального иммунитета (В-системы лимфоцитов); недостаточность системы фагоцитов (макро- и микрофагов); недостаточность системы комплимента; комбинированная иммунная недостаточность /2/.

При иммунодефиците чаще всего наблюдается: осложнения за счет других инфекций, вторичная инфекция, снижение продуктивности, высокая выбраковка, слабая реакция на вакцинацию /3/.

Различают первичные (врожденные) и вторичные (приобретенные) иммунодефициты. Первичные иммунодефициты обусловлены генетической неспособностью организма осуществлять иммунный ответ, вторичные иммунодефициты связаны с действием на организм некоторых вирусов, бактерий, паразитов, нарушением обмена веществ, влиянием токсических препаратов, ионизирующей радиацией, нарушением в передаче колостральных антител /4/.

Для диагностики иммунодефицитов у животных используют комплекс методов, включающий в себя оценку естественной резистентности и иммунной реактивности. Самыми известными и наиболее зарекомендовавшими себя, считаются методы определения фагоцитарной, бактерицидной, лизоцимной и копмлементарной активности сыворотки крови, а также относительного и абсолютного количества Т- и В-лимфоцитов /2; 5/.

Основным недостатком этих методов является большая трудоемкость. Они требуют специального оборудования и, как правило, не доступны для широкой практики.

Кроме того, необходимо учитывать, что имеющиеся нормативы иммунологических показателей разных видов животных весьма условны и могут существенно отличаться в зависимости от породы, возрастных и физиологических особенностей /6/. Это сильно затрудняет интерпретацию полученных результатов.

Прототипом изобретения является разработанный в медицине способ диагностики вторичных иммунодефицитов, основанный на определении величины естественного ингибирующего фактора макромолекулярных антител (ЕИФ) в сыворотке крови, при помощи реакции ингибирования агглютинации (РИА) /8/.

Метод заключается в определении изменения агглютинирующих свойств видовых агглютинирующих антибактериальных (или гемагглютинирующей) сывороток (тест-сывороток) с заранее известными титрами после их контакта с испытуемыми сыворотками крови экспериментальных животных.

Агглютинирующие сыворотки разводят физиологическим раствором 1:20, испытуемые сыворотки - 1:40. Оба раствора соединяют в равных объемах (1,0 мл) в пробирках емкостью 2,0-2,5 мл и плотно закрывают резиновыми пробками. Смеси выдерживают 18 часов при + 37°С. С полученными смесями ставят реакцию агглютинации, начиная с разведения 1:80 с соответствующим диагностикумом. На другой день учитывают результаты реакции агглютинации в каждой пробирке по четырехкрестной системе:

четыре креста ++++ означают полное просветление жидкости в пробирке при наличии ясно выраженного осадка (в виде раскрытого зонтика). При встряхивании осадок распределяется в виде хлопьев, крупинок, комочков в совершенно прозрачной жидкости.

+++ означают те же явления, что и при четырехкрестовой оценке, но жидкость, особенно после встряхивания, слегка опалесцирует (не достаточно полное просветление).

++ ставят, если просветление жидкости выражено слабо; имеется наличие зонтика, который при встряхивании разбивается на хлопья, крупинки или комочки.

+ означает отсутствие или весьма незначительное просветление жидкости при наличии слабо выраженного зонтика или его следов. При встряхивании в жидкости заметны крупинки, комочки.

Знак - означает отрицательную реакцию агглютинации, отсутствие просветления и осадка в виде зонтика. Возможен осадок в виде точки, при встряхивании он легко разбивается в равномерную муть.

При оценке результатов реакции имеют значение не только титр, но и интенсивность реакции агглютинации, которая выражается суммарным титром.

Суммарный титр - это сумма показателей интенсивности реакции агглютинации во всех разведениях данной тест-сыворотки. В качестве контроля используют данные, полученные при контакте тест-сыворотки с физиологическим раствором. Реакция ингибирования считается положительной, если индекс ингибирования (ИИ РИА) превышает 1,2. Индекс ингибирования определяется как отношение суммарного титра тест-сыворотки, определяемого после ее контакта с физиологическим раствором, к суммарному титру после ее контакта с испытуемой сывороткой.

Недостатком этого способа является его трудоемкость.

Техническим результатом заявленного изобретения является повышение чувствительности способа и снижение его трудоемкости, позволяющее выявить всех иммунодефицитных животных и адаптировать способ к массовым исследованиям сыворотки крови в ветеринарии.

Способ осуществляется следующим образом. Исследуемые сыворотки разводят физиологическим раствором хлористого натрия 1:40. Тест-сыворотку разводят физиологическим раствором 1:20. В качестве тест-сыворотки используют гемолитическую сыворотку к эритроцитам барана. Если исследуют не одну, а несколько сывороток крови, то соответственно увеличивают количество рабочего раствора тест-сыворотки.

1 мл рабочего раствора тест-сыворотки (1:20) смешивают с 1 мл рабочего раствора исследуемой сыворотки (1:40) в пробирке емкостью 2,0-2,5 мл и плотно закрывают корковой или резиновой пробкой. В качестве контроля используют смесь 1 мл тест-сыворотки (1:20) с 1 мл физиологического раствора. Смеси помещают в термостат при температуре +37°С до следующего дня или на 3-4 часа (минимальное время инкубации).

На следующее утро или через 3-4 часа этого же дня со смесями ставят реакцию гемагглютинации методом двукратных серийных разведений в полистироловых планшетах с объемом лунок 2 мл. Для этого в ряд лунок пипеткой наливают по 1 мл физиологического раствора. В первую лунку вносят 1 мл тест-сывортки из смеси в пробирке емкостью 2-2,5 мл и после перемешивания пипеткой переносят 1 мл во вторую лунку, из второй - в третью и т.д. Смеси разводят до титра 1:10240. Из последней лунки 1 мл конечного разведения сыворотки выливают. Так поступают с исследуемыми и контрольной смесями.

Затем во все лунки добавляют по 2 капли (0,05 мл) диагностикума. В качестве диагностикума используют 3% взвесь эритроцитов барана. Содержимое лунок тщательно перемешивают постукиванием по краям планшета до образования равномерной взвеси и оставляют при температуре +37°С. Результаты учитывают через 2-3 часа после завершения проведения реакции.

Учет результатов проводят визуально по степени агглютинации эритроцитов по 4-крестной системе:

++++ агглютинировавшие эритроциты должны ровным слоем выстилать дно лунки, образуя по форме купол;

+++ на фоне равномерно агглютинировавших эритроцитов отмечается широкое кольцо с тонким неровным "фестончатым" краем, представляющие собой неагглютинировавшие эритроциты;

++ на фоне равномерно агглютинировавших эритроцитов отмечается менее широкое кольцо с более ровными краями, представляющее собой осадок неагглютинировавших эритроцитов;

+ значительная часть эритроцитов не агглютинируется и оседает на дно лунки в виде кольца с четким краем, вместе с тем имеется небольшое количество агглютинировавших эритроцитов;

- эритроциты оседают в центре лунки в виде диска или компактного кольца с четким краем.

При оценке результатов реакции учитывается не только титр, но и интенсивность реакции агглютинации, которая выражается суммарным титром. Суммарный титр - это сумма показателей интенсивности реакции агглютинации во всех разведениях данной тест-сыворотки. В качестве контроля используют данные, полученные при контакте тест-сыворотки с физиологическим раствором. Индекс ингибирования определяется как отношение суммарного титра тест-сыворотки, определяемого после ее контакта с физиологическим раствором, к суммарному титру после ее контакта с испытуемой сывороткой.

Технический результат достигается постановкой второй части реакции гемагглютинации не в пробирках, а на планшетах. При этом отпадает необходимость для оценки интенсивности реакции встряхивать агглютинат, на что уходит в 5-10 раз больше времени, а сама реакция становится более наглядной. Т.о. становится намного проще и быстрей учитывать результаты.

Было установлено (см. чертеж), что при постановке 2 части РИА на планшетах величина индекса ингибирования уменьшается в 1,08 (Р<0,01) раз по сравнению с величиной ИИ, рассчитанной при постановке 2 части реакции с теми же сыворотками в пробирках. Поэтому РИА при постановке на планшетах должна считаться положительной при ИИ, равном 1,1 и более (1,2:1,08=1,11).

Анализ данных в научно-технической и патентной литературе не выявил способа диагностики вторичных иммунодефицитов у крупного рогатого скота при помощи реакции ингибирования агглютинации.

Диагностика вторичного иммунного дефицита с использованием заявляемого способа проводилась на 30 коровах симментальской породы, принадлежащих ФГУП ПЗ "Кировский". Проведенные опыты показали эффективность и осуществимость заявляемого способа.

Нами было доказано, что при ИИ 1,1 и больше у животных достоверно ниже содержание Т- и В-лимфоцитов по сравнению с животными, у которых он менее 1,1.

Так у коров за 2,5-2 месяца до отела с ИИ, меньше 1,1 процент Т- и В-лимфоцитов был выше в 1,3 раза (Р<0,001) по сравнению с животными, у которых ИИ был больше 1,1. Та же тенденция сохранялась и у коров после отела: при величине ИИ меньше 1,1, процент Т-лимфоцитов был выше в 1,2 раза (Р<0,05), а В-лимфоцитов - в 1,5 раза (Р<0,05), чем у животных с ИИ больше 1,1 (таблица).

Таблица
Показатели Т- и В-лимфоцитов у крупного рогатого скота при ИИ<1,1 и ИИ>1,1№ п/пГруппа животныхЗначение Т-лимфоцитов (%) при:Значение В-лимфоцитов (%) при:  ИИ<1,1ИИ>1,1ИИ<1,1ИИ>1,11Коровы 2,5-2 месяца до отела29,09±1,75^*** (n=25)22,76±0,97 (n=10)23,71±2,13 (n=25)18,56±2,9 (n=10)2Коровы после отела27,89±1,74^* (n=28)22,34±2,11 (n=7)12,35±1,22^* (n=26)8,4±1,14 (n=7)* - Р<0,05
*** - Р<0,001

Таким образом, было установлено, что для крупного рогатого скота ИИ, равный 1,1 и больше, свидетельствует о наличии приобретенного иммунодефицита.

Известно, что наиболее распространенной патологией в сухостойный период является субклинический мастит 191.

Учитывая вышесказанное, нами были проведены исследования по изучению широты распространения ЕИФ среди крупного рогатого скота, а также его связи с заболеваемостью животных в сухостойный период субклиническим маститом и возникновением послеродовых заболеваний.

По результатам исследования сыворотки крови, взятой за 2,5-2 месяца до отела, животные были разбиты на 2 группы по 15 голов в каждой. В 1 группу вошли коровы с ИИ, равным 1,0-1,03, а во 2 - 1,13-1,26.

В 1 группе на момент исследования заболеваемость субклиническим маститом составляла 46,7%, во 2 - 60%. В последующем процент послеродовых заболеваний в 1 группе был равен 60%, во 2 - 80%.

Из полученных результатов видно, что заболеваемость животных в 1 группе (ИИ равен 1,0-1,03) была в среднем на 20% ниже, чем у животных 2 группы (ИИ равен 1,13-1,26).

Таким образом, обнаружение в сыворотке крови ЕИФ с ИИ равным 1,1 и более, является показателем наличия иммунологической недостаточности в организме, способствующей возникновению маститов и послеродовых заболеваний.

Нами было также установлено, что у телят 2-7 дневного возраста, родившихся от коров, у которых за 1,0-1,5 месяца до отела индекс ингибирования был равен или больше 1,1, показатели гуморального и клеточного иммунитета снижены по сравнению с телятами, у матерей которых в сыворотке крови в аналогичный период индекс ингибирования был ниже 1,1. Причем у телят, родившихся от коров с положительной РИА, умеренное и тяжелое течение омфалита и диареи встречается в 2, а бронхопневмонии - в 3,2 раза чаще, чем среди телят, полученных от отрицательно реагировавших коров в РИА в аналогичный период.

Проведенные исследования показали, что предложенный способ диагностики вторичных иммунодефицитов прост и эффективен. Он может быть внедрен в широкую практику.

Источники информации

1. Федоров Ю.Н. Иммунодефицита домашних животных. / Ю.Н.Федоров, О.А. Верховский. - М. - 1996. - 95 с.

2. Карпуть И.М. Иммунология и иммунопатология болезней молодняка. / И.М.Карпуть. - Мн.: Ураджай. - 1993. - 288 с.

3. Ковалев М.М. Иммунопрофилактика и терапия болезней молодняка. / М.М.Ковалев. // Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. Мат. межд. научно-практической конференции 23-25 сентября 2002 г. - Воронеж. - 2002. - С.321-324.

4. Федоров Ю.Н. Иммунодефицита у животных: характеристика, диагностика и коррекция. / Ю.Н.Федоров, О.А.Верховский, М.А.Костына // Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки России. - М. - 1999. - Т.2. - С.138-141.

5. Бояринцев Л.Е. Методы тестирования иммунологической резистентности сельскохозяйственных животных. / Л.Е.Бояринцев, А.Г.Шахов, А.И.Ануфриев. - Воронеж. - 2002. - 56 с.

6. Донник И.М. Иммунограмма животных в клинической практике. / И.М.Донник. // Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. Мат. межд. научно-практической конференции 23-25 сентября 2002 г. - Воронеж. - 2002. - С.11-13.

7. Журавлева Н.В. Антителообразование и ингибиция активности антител при кровопусканиях. / Н.В.Журавлева. - М. - 1979. - 130 с.

8. Журавлева Н.В., Родосская Н.К. Иммунодефицита и естественное ингибирование активности макромолекулярных антител. - Воронеж: Издательство Воронежского университета, 1988. - с.80-81.

9. Притыкин Н.В. Субклинический мастит у коров в сухостойный период, его профилактика и терапия с использованием фурадина. Автореф дисс.... канд. вет. наук. / Н.В.Притыкин. - Воронеж. - 2003. - 20 с.

Изобретение относится к ветеринарии. Способ диагностики вторичных иммунодефицитов у крупного рогатого скота при помощи реакции ингибирования агглютинации включает разведение тест-сывороток и исследуемых сывороток физиологическим раствором хлористого натрия, инкубацию их при 37°С, проведение реакции гемагглютинации методом двукратных серийных разведении, смешивание исследуемых разведений сывороток с диагностикумом, повторную инкубацию при 37°С и определение индекса ингибирования, причем реакцию гемагглютинации методом двукратных серийных разведении проводят на планшете и при индексе ингибирования, превышающем или равном 1,1, диагностируют вторичный иммунодефицит. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности способа и снижение его трудоемкости, позволяет выявить всех иммунодефицитных животных и адаптировать способ к массовым исследованиям сыворотки крови в ветеринарии. 1 ил., 1 табл.

Способ диагностики вторичных иммунодефицитов у крупного рогатого скота при помощи реакции ингибирования агглютинации, включающий разведение тест-сывороток и исследуемых сывороток физиологическим раствором хлористого натрия, инкубацию их при 37°С, проведение реакции гемагглютинации методом двукратных серийных разведений, смешивание исследуемых разведений сывороток с диагностикумом, повторную инкубацию при 37°С и определение индекса ингибирования, отличающийся тем, что реакцию гемагглютинации методом двукратных серийных разведений проводят на планшете и при индексе ингибирования, превышающем или равном 1,1, диагностируют вторичный иммунодефицит.