Способ получения вещества, стимулирующего пролиферативный процесс эндокринного отдела поджелудочной железы Советский патент 1990 года по МПК A61K35/39 

(46) 07.09.90.БЮЛ. 33 . (21) 4151835/28-14 22) 03.12.86

(71)1-й Московский медицинский институт им. И.М, Сеченова

(72)Э.И. Гальперин, О.Ю. Абакумова и Н.Н, Ионочкияа

(53) 612.015(088.8) (56) Бабикова ., Биюмкии В.Н., Шальнев Б.И., Полонская Л.Б. Клеточные культуры из поджелудочной железы плодов крупного рогатого citoTa, полученные с пр1тенением коллалитИна. Бюп. экспер. биологии и медицины, 1977, т.83, f 3, с.350-353.

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА СТИМУЛИРУЮЩЕГО ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ ПРОПЕСС ЭНДОКРИННОГО ОТДЕЛА ПОДЖЕЛУДОЧЙСА ЖЕЛЕЗЫ

(57) Изобретение относятся к.эодокрй- нопогии. Пслжелудочные железы измельчают, диспергируют в 0,ЗХ-ном растворе коллагштина и ресуспецдиру ют в среде 199. Осадок гоногенизиру- ют. Гомогенат центрифугирует, над- осадочную жидкость прогревают, центрифугируют и фипьтрз ют. Полученное вещество обеспечивает более раннюю и полноценную компенсацию инсуляр-г ной недостаточности.

15

20

1

Изобретейие относится к медицине, а именно к эндокринологии.

Цель достигается путем использования регенерирующей поджелудочной г железы взрослого донора, из которой вьщеляют островки Лангерганса, а из них после соотвегствующей обработки получают средство содержащее факторы, стимулирующие пролиферацию (ФСП) ю островков Лангерганса в поджелудочной железе после ее обширных резекций.

Способ осуществляют следующим образом.

Для получения средства используют регенери1рующую .поджелудочную железу troK) крыс-доноров. Для этого у 170 беспородных белых крыс-самцов массой 200-220 г под эфирным наркозом после среднесрединной лапаротомии производят резекцию селезеночного отдела поджелудочной железы (что по массе Составляет 50%) и спленэктомию (так как поджелудочная железа в этом отделе имеет интимную СВЯЗЬ с сосудами селезенки). Срединную рану ушивают наглухо. .

Через 36-А4 ч доноров забивают методом декапитации и сраАу же забирают поджелудочную желе:, которую 1томещают в чагику Петри (манипуляции проводят при ). Масса полученной Ж от рсех доноров 80 г. .

Островки Лангертакса вьщеляют из полученной ткани, т.е. из регенерирующей ПЖ по следующей методике.

Подл .елудочную железу (масса 80 г) тг.щнергают механическому измельчению ::.о;А Шцами, после чего продавливают через сетку с диаметром пор 1-2 мм. Фрагменты ПЖ диспергируют в 0,3%-ном pacysope Коллалитина (активность - mg.,приготовленного на раство1412061.2

и С в течение 20 мин. Надосадочную жидкость (290 нгт) прогревают при температуре в течение 15 мин. Повторно центрифугируют при тех же условиях и фильтруют через миллипоровый фильтр Aufs 0,3-0,6 мк (Сынпор, ЧССР).

Полученное вещество в колич естве 280 мл содержит до 0,5 мг/мл белка (определенного по методике Лоури) и приводит к стимуляции синтеза ДНК В ткани ПЖ крыс с инкреторной недостаточностью в 1,9; 3,2 и 2,6 раз соответственно через 10,12 и 24 ч после введения.

Определение активности вещества.

Активность полученного вещества определяют на 30 беспородньк белых крыса-самцах массой 160-180 г, у которых ИН вызывают по следующей схеме: производят резекцию 50% ткани. ПЖ (по вьгаеописанной методике), череа 24 ч и 48 ч им внутрибрюшинно вводят 5%-ный водный раствор Аллоксана (фирмы Chemapol, ЧССР). Ч ерез 48 ч после последней инъекции Аллоксана у крыс развивается инкреторная недостаточность, проявляющаяся клиникой сахарного диабета (глюкоза крови - 276, мг%). В 3Tif сроки 15 крысам с ИН внутрибрюшинно в дозе 1 мп вводят полученное средство, содержащее ФСП (опыт), 15 крысам в той же дозе вводят внутрибрюшинно физиологический раствор (контроль). -,

Активность вещества оценивают по степени его влияния на синтез ДНК в ткани ПЖ у крыс опытной и контрольной групп. Синтез ДНК в ткани ПЖ определяют через 10,12,20 и 24 ч после введения средства и физиологического райтвора.

Синтез ДНК (удельную активность

25

30

35

40

р2 Kanks (80 мл) в течение 20 мин в магнитной мещалке при 20-22 С. После д ДНК) определяют после внутрибрюшиино- о гстаивания фрагментов ПЖ надосадоч- гр введения Н -тимидина (СССР) по йую жидкость сливают. Осадок трижды (есуспендируют в среде № 199 (70 мп) с последукяцим отстаиванием и удалением надосадочной жидкости. Из полученной смеси ОЛ (70 мл) получают вещество для коррекции инсулярной недостаточности, Взвесь ОЛ (70 мп) гомогенизируют в гомогенизаторе тефлон-стекло (в модификации Поттера) при в

50

55

100- мкКи на крысу. Время экспозиции 90 мин. Животных забивают методом декапитации, после чего сразу забирают ткань ПЖ и помещают ее в лед. Ткань гомогенизируют в гомогенизаторе теф- лон-с.текло (а модификации. Поттера) при в 3 объемах 0,05 М трис-НС1-., буфера, рН-7,7, содержащего 0,25 М сахарозу 0,005 М MgClj, и 0,025 М КС1. В аликвотах гомогената определянгг (в 0,1 мл) удельную радиоактивность и содержание ДНК. Удельную радиоактивность определяют после осаждения

трех объемах дистиллированной воды (240 мп) в течение 1 мин.

Гомогенат (320 мп)- центрифугируют на центрифуге К-70 при об/мкн

ДНК) определяют после внутрибрюшиино- гр введения Н -тимидина (СССР) по

100- мкКи на крысу. Время экспозиции 90 мин. Животных забивают методом декапитации, после чего сразу забирают ткань ПЖ и помещают ее в лед. Ткань гомогенизируют в гомогенизаторе теф- лон-с.текло (а модификации. Поттера) при в 3 объемах 0,05 М трис-НС1-., буфера, рН-7,7, содержащего 0,25 М сахарозу 0,005 М MgClj, и 0,025 М КС1. В аликвотах гомогената определянгг (в 0,1 мл) удельную радиоактивность и содержание ДНК. Удельную радиоактивность определяют после осаждения

кислоторастворимого материала 10%- ной ТХУ и нанесения его на миллипоро вые фильтры (№ 2 Synpor, ЧССР) в жидкостном сцинтйлляционном счетчике Merk II (Nuclear Chicago, СИЛА) в сгдинтилляторе ЖС-106 (СССР). Содержание ДНК определяют по методу Влобеля и Поттера. Результаты вьгражают в импульсах в 1 мин,

В результате получают данные, что введение вещества приводит к стимуляции синтеза ДНК в ткани ПЖ крыс с экспериментальной инкреторной недосг таточностью через 10,12 и 24 .ч соот- ветственно в 1,9; 3,2и 2,6 раз (по сравнению с контрольной группой).

В опыт взято 18 беспородных собак обоего пола, массой от 5 до 18 кг. Всем произведена субтотальная (85%) резекция поджелудочной железы с пере ,вязкой панкреатического протока. Животные разделены на две группы: в первой (10 собак), введения средства не производили (контроль) , во второй (8 собак). Животным внутрибрюшинно сразу же после операции вводят Полученное средство из расчета 4,0-5,0 м на 1 кг массы тела (опыт), средство имеет следующую характеристику: содержание белка - не более 0,5 мг/мл, активность - усиление синтеза ДНК в тк-ани ПЖ крыс с ИН в 1,9J 3,2 и 2,6 раз соответственно через 10,12 и 24

В послеоперационном периоде у животных первой группы уровень глюкозы в крови натощак остается высоким в течение 3 нед после операции, а толе рантйость к глюкозе - сниженной на протяжении всего периода наблюдения (1 нес.). Это обусловлено снижением секреции инсулина, о чем свидетельствовало уменьшение содержания инсулин и С-пептидов в крови натощак и в процессе проведения -сахарной нагрузки. Кроме Toroj отмечается временное (в течение 2 нед.) повьопение уровня контрисулярного гармона - глюкагона,

Дпя гистологической картины ПЖ в различные сроки после операции у животных данной группы было характер но нарастание дистрофии, фиброза и атрофии ацинусов и части островков Лангерганса. Однако наряду с этим в ПЖ спонтанно протекают репаративны процессы (гипертрофия ОЛ, увеличение количества переходных ациноостровко- вых клеток), которые и определяют временный характер гипергликемии, Од

.

- 1412061

нако эти процессы не обеспечивают полноценной компенсации ннсулярной недостаточности, о чем свидетельствует низкий уровень инсулина и С-пептн10

20

- jj

- 25 л . ч.

- у реципиента, , 30

35

40

45

50

да, а также снижение толерантности к глюкозе на протяжении всего периода наблюдения.

Во втврой группе (опыт) введение средства приводит к снижению содержа ния глюкозы в крови натощак уже со 2 сут. после операции и вплоть до конца наблюдения и к стабильной компенсации ИН (т.е. к нормогликемии) с нормализацией толерантности к глюкозе уже со 2 нед. после операции. Это сопровождалось усилением синтеза инсулина (достоверным повышением содержания инсулина и С-пептида в крови натощак и в процессе проведения са-- харной нагрузки), а также менее значительным увеличением содержания глю- кагона.

Введение препарата (средства) приводит к значительным морфологическим изменениям в оставшейся части 1Ш отмечается выраженная гипертрофия и увеличение количества ОЛ и ацин6ост ровковых клеток (достоверно выше, чем в контроле) . В ОД обнаруткиваются единичные фигуры митозов.

Таким образом, введение полученного средства собакам, перенесшим обширную резекцию ПЖ (85%), стимулирует спонтанно протекающие в ней репаративные процессы и приводит к более ранней и полноценной компенсации ИН,. не вызьтая при этом аллергических реакций.

Преимуществом предлагаемого способа получения средства для коррекции инсулярной недостаточности является следующее.

В качестве доноров можно использовать взрослых животньпс, что (технически) облегчает получение средства; необходимость культивирования полученных ОЛ отпадает;.

Можно использовать ПЖ от нескольких доноров, так как предлагаемый способ обработки ксено-ПЖ предусматривает удаление из ткани Щ1 термолабильных белков и снижает возможность возникновения аллергических реакций

у реципиента,

Средство, приводя к стимуляции процессов репаратрш в оставшейся после 85%-ной резекции части ПЖ, обеспечивает образование новых функционально активных эндокринных элементов

леэы, включающий измельчение резерци рованных поджелудочных желез крыс,, диспергирование в 0,3%-ном растворе

ПЖ - собственных ОЛ, функционирование, коллалитина при 20-22 С, ресуспенди . , . а Л .

которых обеспечивает компенсацию ИН и нивелирование Клиники сахарного ди&бета у экспериментальных животных.

Формуланэ обретения ю

«

Способ получения вещества, стимулирующего пролиферативный процесс эндокрийного отдела поджелудочной жерование в среде № 199, далее/, осадок гомогенизируют в дистиллированной воде 1-2 мин при 4±,0,1°С, гомогенат центрифугируют при 3000 об/мии q течение 20-30 мин, надосадочную жидкост прогревают при т.кип. воды в течение 15-20 ьмн, повторно центрифугируют в тех же условиях, фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,3-0,6 мк.

леэы, включающий измельчение резерци- рованных поджелудочных желез крыс,, диспергирование в 0,3%-ном растворе

коллалитина при 20-22 С, ресуспенди . а Л .

рование в среде № 199, далее/, осадок гомогенизируют в дистиллированной воде 1-2 мин при 4±,0,1°С, гомогенат . центрифугируют при 3000 об/мии q течение 20-30 мин, надосадочную жидкост прогревают при т.кип. воды в течение 15-20 ьмн, повторно центрифугируют в тех же условиях, фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,3-0,6 мк.