Способ получения гиббереллина Советский патент 1961 года по МПК C05F11/08 A01N63/00 A01N43/12 C12P17/04 

Известные способы получения гиббереллнна предусматривают в качестве источника азота для его биосинтеза виннокислый аммоний, а в качестве элуирующих растворителей при выделении гиббереллина метанол + аммиак, ацетон, ацетон + аммиак.

Существенным недостатком этих способов является дороговизна и дефицитность азота, а также токсичность и взрывоопасность применяемых растворителей.

Предлагаемый способ позволяет заменить дорогое, дефицитное, токсичное и взрывоопасное сырье и заключается в том, что в отличие от известных способов, глубинное культивирование штампов гриба Fusarium moniliforme производят на ферментационной среде, состоящей из сахара, ацетата аммония, кислого фосфата калия, сульфатов калия и магния и кашалотового жира при температуре 27-28° и значении рН 6,8-7,2. Последующее выделение гиббереллина осуществляют адсорбцией на активированном угле и затем десорбцией смесью бутанол- вода и экстракцией слабым раствором бикарбоната натрия и этилацетатом.

Пример 1. Подготовка посевного материала.

Небольшое количество исходной культуры (штаммы С-14, 8-S ИЛИ 8-10 из коллекции ВИУА ВАСХНИЛ) с агаризованной синтетической среды засевают в колбы, содержащие 100 мл стерильной культуральной среды следующего состава (г/л): сахар пищевой 25,0; аммоний ВИННОКИСЛЫЙ 7,0; калий фосфорнокислый однозамещенный 2,0; магний сернокислый 0,2; калий сернокислый 0,2; смесь микроэлементов 1,0 мл. Культура выращивается в колбах на ротационной качалке при 28, после чего 3 мл жидкой культуры стерильно переносят в стеклянный флакон, содержащий полуразваренное стерильное пшено. Проращивание производят в термостате при 27° на протяжении 5 суток, после чего флаконы с содержимым подвергают вакуумной сушке при

N 141352- 2 остаточном давлении 10-15 мм рт. ст. и 25° до остаточной вместимости, не превышающей 7%.

Пример 2. Ферментация.

Небольшое количество пшена с конидиями продуцента вносят в колбу, содержашую 100 мл стерильной среды вышеуказанного состава и продуцент вырашивают 48 час на ротационной качалке при 28°. Содержимое колбы передается на инокулятор-ферментер, содержащий 26 л стерильной питательной среды того же состава. Инокулирование производят при перемешивании со скоростью 300 об/мин и продувании 26 л воздуха в минуту, температура регулируется по уровню 27+ 1°. После 48 час роста инокулит в количестве 10% передают в ферментер для получения гиббереллина. Питательная среда содержит (г/л): сахара пищевого 40,0, аммония уксуснокислого 5,8, калия фосфорнокислого однозамещенного 2,0, калия сернокислого 0,2, магния сернокислого 0,2; раствора микроэлементов 1 мл, кашалотового жира 5,0; рН -- -6,8-7,2. Выращивание производят при температуре 27+1°, перемешивании 400 об/мин, аэрации 1,5 объема воздуха на 1 объем среды в .минуту.

3. Выделение активного кристаллического препарата

36 л отфильтрованной культуральной жидкости подкисляют 2н. НС1 до рН 2,5 и адсорбируют активное начало при перемешивании в течение 2 час с активированным углем. Отфильтрованный уголь промывают 1 л дистиллированной воды при отсасывании и элуируют 2,5 л смеси, состоящей из 25 объемных ч. бутилового спирта, 73 ч. воды и 2 ч. 20%-ного водного аммиака. После 8 час перемешивания добавляют к суспензии 125 мл 1 и. раствора однозамещенного фосфорнокислого калия, 23 мл 25%-ного раствора хлористого кальция и отфильтровывают на нутгфильтре. Для повторного элуирования обрабатывают отфильтрованный уголь 0,8 л щелочной смеси бутанола с водой вышеуказанного состава. Объединенные элуаты подкисляют 2 н. НС1 до , добавляют 2,5% хлористого натрия, после разделения фаз отделяют слой растворителя, а водную фазу повторно экстрагируют 0,5 л бутилового спирта. Объединенный бутанольный экстракт обрабатывают последовательно 0,4%, 0,3% и 0,2%-ными растворами бикарбоната .натрия, используя для каждой экстракции 0,2 объема. Объединенный ВОДНЫЙ экстракт подкисляют 2н. НС1 до ,5 и трижды экстрагируют этилацетатом по 0,2 объема (от органической части раствора). Этилацетатный раствор обезвоживают гранулированным хлористым кальцием, отфильтровывают и отгоняют растворитель при остаточном давлении 10 мм рт. ст. до начала кристаллизации. В результате выделяют 3,5 г бесцветных кристаллов с т. пл. 223-224° и удельным вращением а +76°. Концентрированием маточника получено еще 0,34 г вещества с т. пл. 220-222°, вращением + 76°. Концентрированием маточника получено еще 0.34 г венхества с т. пл. 220-222°, вррдцением fal -;-70°.

П р е д м с т и 3 о б р е т е н и я

Способ получения гиббереллина путем глубинного культивирования штаммов Fusarium moniliforme на (питательной ареде, содержащей источники азотного и углеродного питания, отличающийся тем, что. с целью расширения сырьевой базы, в качестве источников азотного и углеродного питания, используют сахар, кашалотовый жир и ацетат аммония при нейтральном значении рН.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целые увеличения выхода, гиббереллин выделяют из культуральной среды путем сорбции на активированном угле с последующей десорбцией смесь бутанол-вода и экстрагируют этилацетатом.