СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГИББЕРЕЛЛИНА ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ГРИБА FUSARIUM MON1LIFORME Советский патент 1970 года по МПК C12P27/00 

Изобретение относится к способам получения гормональных препаратов-регуляторов роста растений, в особенности, к способам выделения этих веществ из микробных культур и, в частиости, к способам выделения гиббереллинов из культуральных жидкостей мицелиального гриба.

Препарат гиббереллина, .применяемый в качестве стимулятора роста растений, .представляет собой смесь гиббереллинов, основным из которых является гибберелловая кислота (ГК). Эти вещества получают путем микробного синтеза, выделяя их из культуральной жидкости гриба-продуцента Fusariurn moniliforme.

Известны способы выделения гиббереллинов из культуральной жидкости, основанные «а адсорбции активным углем, экстрагировании из фильтрата жидкой культуры и ионном обмене.

Известные способы выделения гиббереллина из культуральной жидкости неудобны тем, что они требуют применения большого количества взрыво- и огнеопасных оргаиических растворителей на первых стадиях производственного процесса, использования больших количеств сравнительно дорогостоящих или дефицитных сорбентов, высокие энергетические затраты при сушке больших объемов водных растворов.

Предложено выделение гиббереллнна осуществлять лутем его осаждения ионами двухили трехвалентного железа (Fe-|-р. F+ + + ) в присутствии ионов хлора (С1-).

Ионы двух- и трехвалентного железа при значениях рН 3-3,5 переводят гибберелловую кислоту из водного раствора в осадок, который легко отделяется фильтрованием. Для осаждения гиббереллинов пригодна любая соль железа, в частности, дешевые н недефицитные хлористое (Fe СЬ) и хлорное железо (Fe С1з).

В культуральную жидкость вносят хлористый барий, после чего отделяют мицелий, например, фильтрованием. В полученный фильтрат вносят хлорное железо и хлористый натрий, растворяют перемешиванием и доводят реакцию раствора до рН 3,2-3,4. Выпавший осадок отделяют фильтрованием. Осадок представляет собой комплексное соединение гнббереллина с хлорным л елезом и может быть использован либо путем непосредственного применения в се.тьском хозяйстве, либо для получения кристаллического гиббереллина.

При применении его в сельском хозяйстве осадок сушат, размельчают и вьшускают с завода в виде порошка с маркой «технический гиббереллин, а при получении кристаллического гнббереллина осадок обрабатывают Мицелий (не утилизируется) Фильтрат (не утилизируется) Осадок (не утилизируется) Отработанный водный раствор (не утилизируется) Высоленная вода (не утилизируется) Отработанный уголь (ни утилизируется) Отгон этилацетата (на эк стра«цию)

водньгм аммиаком, нерастворившуюся часть осадка удаляют фильтрованием. Раствор, представляющий собой водно-аммиачный концентрат гиббереллина, подкисляют до рН 2,0- 2,2, и гиббереллин экстрагируют этилацетатом. Этилацетатный концентрат сушат хлористым Кальцием, очищают активным углем и упаривают лод вакуумом до выделения кристаллов гиббереллина.

Пример 1. Осаждение гибберелловой кислоты из водных растворов солями железа. Раствор кристаллического гиббереллина в воде разделяют на части по 500 мл и осаждают различньгми солями железа при рН 3,2-3,4. Количество каждой соли определяют из расчета 1 г содержашегося в пей железа на г гиббереллина.

Берут соли хлорного железа РеСЬ азотнокислое л елезо Ре(КЮз)з, сернокислое железо Ре2(5О4)з, хлористого железа FeCgl и серноКИСЛОГО железа FeS04. После добавления солей, перемешивания и доведения рН до 3,2- 3,4 выдерживают 2 час. Выпавший осадок отделяют на воронке Бюхнера (фильтровальная бумага), сушат и взвешивают.

Исходный раствор, осадок и маточник анализируют на содержание гиббереллипа фотоколориметричеоким способом с предварительной очисткой бутанолом.

Пример 2. Получение технического препарата-комплексного соединения гиббереллина с железом.

К 1500 л культуральной жидкости с содержанием гиббереллина 1477 мг/л (в фермептере на 3 лгз) добавляют 75 мл 5%-ного раствора хлористого бария (5% от объема культуральной жидкости). Смесь выдерживают 30/vzuH и отфильтровывают иа рамном фильтрпрессе (F-2,8 м ). Мрщелий на фильтро-прес-5%-ный .раствор ВаСЬ (5% от объема культуральной жидкости)

FeCls 3 г на 1 г ГК, NaC 5%-пый (об. вес.) рг вора

2,0%-ный раствор NH.,OH (2%-ный раствор XliiOH на промывку)

НС1 до рН 2,0-2,2, этилацетат

CaCla, 3-4% (об. вес)

1% активного угля марки А

се промывают водопроводной водой (30 л, 20% к объему культуральной жидкости), фильтрат и промывки собирают в чугунный эмалированный сборник емкостью 2000 л. К полученно.му фильтрату культуральной жидкости в количестве 1550 л с содержанием гиббереллина 1250 мг/л добавляют 5,8 кг технического хлорного железа (из расчета 3 г 100%-ного хлорного железа на 1 г гибберелли-на) и 77,5 кг пищевой поваренной соли (из расчета 5 вес. % соли на объем фильтрата).

Фильтрат перемешивают до растворения добавленных солей, доводят 20%-ным раствором едкого натра рН до 3,2-3,4 и выдерживают 1 час. Выпавший осадок отфильтровывают на рамном фильтре-прессе, фильтрующий материал-бельтинг и бязь по одному слою. По окончании фильтрования осадок па прессе продувают сжатым воздухом и выгружают.

Получепный комплексный осадок, содержащий гиббереллин и другие примеси, сушат на калориферной сушилке при 70-80°С и размалывают на шаровой мельнице (можно на микромельнице). Получают светло-коричневый порошок, содержащий 109,5 кг/г гиббереллипа. Выход гиббереллина от исходного составляет 81%.

Пример 3. Получение кристаллического гиббереллина. К 5,1 л фильтрата культуральной жидкости с содержанием гиббереллина 1690 мг/л (всего 8,6 г гиббереллина) добавляют 25,8 г технического хлорного железа (из расчета 3 г 100%-ного FeClj на 1 г гиббереллина) и 255 г пищевой поваренной солп (из расчета 5 вес. % соли па обт. фильтрата). Фильтрат перемешивают до растворения добавленных со.лей, доподят аммиаком рН до 3,2-3,4 и выдерживают час. Выпавший осадок отфильтровывают на воронке Бюхнеема получения кристаллического гиббереллина Культуральная нсидкость фильтрация Нативный раствор осаждение комплекса и фильтрация Влажный комплекс/осадок разложение комцлекса, промывка ц фильтрация Щелочной концентрат подкисление и экстракция Этилацетатный экстракт сушка Сухой Этилацетатный экстракт очистка углем Очищенный Этилацетатный экстракт вакуум-концентрирование Гнббереллин кристаллический под вакуумом через два слоя фильтроваль бумаги. Полученный шосле фильтрования )ой осадок (вес 178 г, содержание гиббе лина 45 л:з/г) подвергают разложению пу добавлегия 300 лгл 2,5%-ного водного :твора аммиака (из расчета шолучеиия :твора гиббереллина с концентрацией ЮО лг/г) и тщательно перемешивают 1 час. окончаиии перемешивания осадок отдеот на воронке Бюхнера и лромывают на )онке 200 Л1Л 2%-ного водного аммиака )ловина от объема фильтрованной смеси- зло 400 мл}. Основной Концентрат гиббереллина 55 мл с концентрацией 19000 жг/уг) и смыв Ю мл с концентрацией 4250 лг/л) объеди:от, подкисляют крепкой соляной .кислотой рН 2-2,2 и подвергают экстрагированию лацетатом. На первую, вторую и третью ;тракцию берут по 0,2 объема этилацетата объема водного гиббереллйна, а на послеющие экстракции - по 0,1 объема. Экстрагирование ведут до тех лор, пока соржание гиббереллина в водном растворе не йжается до 500-700 лгг/л. Полученный этилетатный экстракт (440 мл с концентрацией )520 лг/уг) cyujaT безводным хлористым льцием, а затем очищают активным углем. 1Я этого к экстракту добавляют 1% (об. г.) щелочного угля марки А, леремешивают мин и отфильтровывают на воронке Бюхра через два слоя фильтровальной бумаги. концентрат упаривают под вакуумом при 45°С до выпадения кристаллов, которые промывают сухим этилацетатом и сущат. В результате получают кристаллы гиббереллина (2,66 г с содержанием активного начал;) 855 .иг/г). Точка плавления препарата 215- 217°С. туральной жидкости гриба Fusarium moniliforme, включающий ее фильтрацию и извлечение гиббереллияа из фильтрата, при кислых значениях рН, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, гиббереллин выделяют путем осаждения его ионами двух- или трехвалентного железа (Fe-j-f-, Fe-|--4- + ) в присутствии ионов хлора (С1-). осадок обрабатывают разбавленным водным аммиаком или другими щелочами; нерастворившуюся часть отбрасывают и из полученного водно-щелочного раствора гнббереллин извлекают зтилацетатом и кристаллизуют изс целью получения технического препарата. осадок отделяют, сушат и размалывают. Высушенный и очищенный этилацетатный Предмет л з о б р е т е Н и я 1.Способ выделения гиббереллина из куль2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что вестными способами. 3.Способ по п. 1, отличаюишйся тем, что, Приоритет по п. 3 от 5 августа 1966 г.