Способ определения активности аргиназы мозга в сыворотке крови Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 

СА9

ел

б9

О

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимической диагностике и неврологии, и может быть использовано для диагностики заболеваний, обусловленных преимущественньгм поражением нейрона, в результате которого в биологических жидкостях появляется активность аргиназы мозга.

Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа при одновременном обеспечении возможности длительного сохранения образцов.

Способ осуществляют следующим разом.

0,02-0,05 мл (20-50 мкл) сьшоротк крови, предварительно обработанной раствором формальдегида до его конечной концентрации 0,15-0,3 мкМ, наносят на фильтровальную бумагу, высуши вают при 40-60 С, 2-3 раза промыва- ют 2%-ным раствором хлористого калия с последующим высушиванием при той ж температуре. Далее обработанную опытную полоску с пробой и контрольную полоску того же размера погружают в раствор аргинина (100 мкМ/мл) на 10 мин и в эти же пробирки вносят по 2 мл стандартного рабочего раствора для определения мочевины. Пробы ставят в кипящую водяную баню на 12 мин. В контрольные обр.азцы аргинин вносят на 2-й минуте пребьшания их в бане. Затем пробы охлаждают (2- 3 мин) под струе-й холодной воды, измеряют .оптическую плотность на спектрофотометре СФ-24 при длине волны 525 нм и выражают результат в единицах (1 ед равна I мкМ/мин).

Всего обследовано 119 человек, из них с диагнозом: острое нарушение мозгового кровообращения (ОНМК) 69, преходящее нарушение мозгового кровообращения 4, гипертоническая энцефалопатия (ГЗ) 11, начальные проявлени неполй И1 енности мозгового к ровообра- щения 4, артериальная гипертония (АГ) + начальные проявления неполноценности мозгового крообращения 2, АГ 6. Диагноз подтверждали данными анамнеза, клинической картиной забо- левания, комплексом клинических и параклинических методов исследования с обязательным использованием компьютерной томографии.

Контрольная группа включает 23 человека, из них доноров 15, больных с рассеянным склерозом 4, остреохонд розом 4,

0

5

Предлагаемый способ позволяет ре-: гистрировать появление специфической активности аргиназы мозга в сьюо- ротке крови при острых нарушениях мозгового кровообращения и ГЭ. О. специфичности предлагаемого способа можно.судить из приведенных примеров. Активность аргиназы не определяли в сьторотке крови здоровых людей ( доноры) и практически не наблюдали у неврологических больных с поражением других структур (см. таблицу).

Активность аргиназы, ед/л

30

0 5

0 з

0

5

Пример 1. Больная Л., 57 лет, диагноз: ограниченное кровоизлияние в глубокие отделы левого полушария, гипертоническая болезнь III ст.

Заболела 16.03.86,. когда внезапно развилась -слабость в правой руке и ноге, изменилась речь.

При поступлении: состояние средней тяжести, глазные щели , правосторонний парез мимической мускулатуры, с;нижёна сила в правой руке, объем движений полный. Отмечается повышение мышечного тонуса по пирамидному типу в правых конечностях. Болевая чувствительность снижена с справа по гемитипу.Сухожильные рефлексы повьш1ены, справа больше, чем слева. Вызьюается ладонно-подбородоч- ньй рефлекс с обеих сторон. Гипергидроз, значительно усиливающийся при повышении АД. Нарушение речи по типу заикания.

Определяли активность аргиназы по следующей методике: сьшоротку крови в количестве 20 мкл, предварительно обработанную раствором фор- j- мальдегида до конечной концентрации О,15 мкМ, наносили на фильтровальную бумагу, высушивали при , 2 раза промывали раствором хлористого калия с последующим высушиванием при той же температуре. Далее опытную

полоску погружали в раствор аргинина на 10 мин и в эти же пробирки вносили по 2 мл рабочего раствора для. определения мочевины. Затем пробы ставили в кипящую водяную баню на 12мин. В контрольные образцы аргинин вносили на 2-й минуте пребывания их в бане. Затем пробы охлаждали и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-24 при длине волны. 525 нм.

Активность фермента в крови, определенная предлагаемым способом, составила 11 ед/л в первый день после ОНМК,

Порал ение ЦНС подтверждено данными компьютерной томографии: в левом полушарии в проекции средне-задних отделов скорлупы бьша определена небольшая область интенсивно повышенной плотности, окруженная небольшой областью пониженной плотности, что соответствует небольшому кровоизлиянию в стадии организации описанной локализации,

П р и м е р 2. Больной П., 59 лет, диагноз: кровоизлияние в правое полушарие головного мозга. При поступлении: сознание ясное, ориентирован на месте и во времени, временами зевота, речь дизартрична. Некоторое снижение напряжения жевательной мускулатуры слева. Гипалгезия левой половины лица. Сглажена левая носогубная складка. Мягкое небо провисает, язычок уклоняется влево. При фонации небная занавеска сокращается несколько ограниченно. При высовывании языка он уклоняется влево. Движение в левой руке отсутствует, в локтевом суставе намек на сгибание, в ноге: выпрямленную ногу поднимает 10 от постели, поставленную ногу с опорой на пятку

не удерживает,в голеностопном суставе движений нет. Мышечн.ый тонус умеренно повьш1ен в сгибателях и пронаторах левого предплечья, в разгибателях левой голени и приводящих мышцах бедра. Сухожильные рефлексы вызьтаются . Брюшные рефлексы справа вызьгоаются, слева отсутствуют. Вызьгаается симптом Бабинского слева. Вызьшается ладонно- подбородочный рефлекс. Отмечается левосторонняя гемигипестезия. Суставно- мышечное чувство: расстроено слева во всех суставах, включая крупные. Активность аргиназы определяли по следующей методике: сьгооротку кро0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

ви в количестве 50 мкл, предварительно обработанную раствором формальдегида до конечной концентрации 0,3 мкМ, наносили на фильтровальную бумагу, высушивали при 60 , 2 раза промьшали 2%-ным раствором хлористого калия с последующим высушиванием при той . же температуре.. Далее опытную полоску погружали в раствор аргинина на 10 мин и в эти же пробирки вносили по 2 мл рабочего раствора для определения моиевины. Затем пробы ставили в кипящую водяную баню на 12 мин. В контрольные образцы аргинин вносили на 2-й минуте пребьтания их в бане. Затем пробы охлаждали и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-24 при длине волны 525 нм.

Активность фермента в крови, определенная предлагаемым способом, составила 55 ед/л. При компьютерной томографии головного мозга в правом полушарии, в проекции, преимущественно, лентикулярного ядра, определяется свежее кровоизлияние средних размеров (не более 20 см) без признаков про- рыва крови в желудочки и субарахно- идальное пространство. Правый боковой желудочек частично сдавлен. Имеются симптомы умеренно выраженной деформации среднего мозга и развивающегося перифокального отека.

П р и м е р 3. Больной Г., 58 лет, диагноз: ГЭ, АГ, атеросклероз.

С 17 лет отмечалось повышение АД. В 1979 году ОНМК с.о слабостью в левых конечностях. С января 1985 г. слабость в ногах.

В неврологическом статусе: память снижена, гипомимичен, отмечается дизартрия. Некоторая сглаженность правой носогубной складки. Кончик языка уклоняется вправо. Отмечается повьшение тонуса в левых конечностях. Сухожильные рефлексы высокие с расширенной рефлексогенной зоной. Клонус стоп. Симптом Маринеску-Родовича справа. Вызьтается кистевой рефлекс Россолимо с 2 сторон. S7D. Симптом .Россолимо, симптом Бабинского слева и Пуссена справа. Брюшные рефлексы не вызьшаются. Походка паретическая, мелкими шажками с элементами атаксии. Координаторные пробы вьтолняет с незначительной интенцией.

Заключение психиатра: изменение личности по органическому типу (сосудистого генеза).

На серии компьютерных у омограмм головного, мозга отмечается диффузное симметричное снижение плотности в белом веществе семиовальных центров обоих полушарий, которое распространяется также на участки нервной ткани, расположенные вокруг тел боковых желудочков (томографические признаки дисциркуляторной энцефалопа- тин). Наблюдаются умеренное и системное расширение желудочковой системы и заметное увеличение субарахноидаль- ного пространств лобных долей, что полностью соответствует клиническим данным.

Активность аргиназы определяли предлагаемым способом .аналогично примерам 1 и 2. Активность мозговой формы фермента в первый день поступления в клинику 177 ед/л. На фоне уменьшения очаговой неврологической симптоматики и улучшения общего состояния на 19-й день активность мозговой формы фермента не выявлялась.

П р и м е р 4. Больной Ш., 44 лет диагноз: ГЭ, гипертоническая болезнь I-II ст. и начальные явления атеросклероза.

В течение последних 15 лет перио- дически повышается АД до 150-160/ /90- мм рт.ст. и 170-180/110 при кризах. В 1983 г. отмечал значительное снижение памяти в течение нескольких дней, которое прошло после лечения. Два года тому назад вновь ухудшилась память, появились затруднение концентрации внимания, трудности в подборе слов, утомляемость, головная боль. Самочувствие ухудшилось за по- следний год, когда головная, боль стала почти постоянной (чаще в затылочной области) , появилось головокру ке- ние. .

В неврологическом статусе: легкий симптом Горнера справа, легкая сглаженность правой носогубкой складки, непостоянный симптом Маринеску-Родо- вича справа. При выполнении пальцено- совой пробы отмечаются элементы ин- тенционного тремора. Гипергидроз ладоней и.стоп.

Заключение психолога: высшие корковые функции не нарушены. Некоторое снижение памяти и особенности поведения личности и установок.

На серии компьютерных томограмм получены изображения суб- и супратен- ториальных образований головного мозга

0 5

0 5

0 Q

з п

5

Патологических изменений в веществе мозга не выявлено. Желудочковая система обычной формы и размеров, суба- рахноидальное пространство не изменено.

Исследование активности фермента проводили предлагаемым способом. В первый день поступления активность мозговой формы фермента составила ПО ед/л, и на 30-й день, когда на фоне лечения регрессировала очаговая неврологическая симптоматика, исчезли головные боли, головокружение, парез лицевого нерва справа, симптом Маринеску-Родовича справа и интенг ционный тремор при выполнении пальце- носовой пробы, активнох ть составила 44 ед/л, что свидетельствует об уменьшении активности процесса.

Таким образом, предлагаемый спо- соЬ является высокочувствительным при определении активности патологического процесса, в частности энцефалопатии.

Полученные результаты показали, что мозговая форма фермента не присутствует в сыворотке крови здоровых людей, в то же время активность аргиназы выявлена в сыворотке крови больных с заболеваниями нервной системы, сопровождающимися пррвреждением нейронов .

Предлагаемый способ обеспечивает снижение травматичности (используется сыворотка крови в объеме 0,03 мкл вместо спинномозговой жидкости), повышение точности, так как позволяет диагностировать умеренно выраженные формы Дисциркуляторной энцефалопатии и некоторые формы нарушения мозгового кровообращения, а также упрощение за счет снижения количества стадий в методике и возможности длительного сохранения образцов.

Формула изобретения

Способ определения активности аргиназы мозга в сыворотке крови путем отбора пробы,обработки ее раствором формальдегида, нанесения смеси на носитель, промьшания раствором хлористого калия, добавления раствора аргинина и инкубации с последующим определением мочевины, отличающийся тем, что,с целью повышения точности и упрощения способа, при одновременной возможности длительного

7 . .8

сохранения образцов, в качестве носи- в объеме 20-50 мкл, затем высушивают теля используют фильтровальную бумагу, при АО-бО С, а инкубацию с раствором на которую наносят сьпзоротку крови аргинина проводят в течение 10 мин.

Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа при од- .новременной возможности длительного сохранения образцов. После обработки формальдегидом сьторотку крови наног ; сят на фильтровальную бумагу, высушивают, промьшают раствором хлористого калия и вновь высушивают. Обработанную опытную полоску с пробой и контрольную полоску погружают в рас- твор аргинина и в эти же пробирки вносят рабочий раствор для определения мочевины. Пробы ставят в кипящую водяную баню на 12 мин. В контрольные образцы аргинин вносят на 2-й минуте пребьшания их в бане. Затем пробы охлаждают и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре. 1 табл. с б (О