Способ получения декапептидов или их фармацевтически приемлемых солей Советский патент 1988 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 

Изобретение относится к способу получения декапептидов или их фармацевтически приемлемых солей - новых биологически активных соединений, которые могут найти приме-нение в медицине.

; Цель изобретения - получение новы )цекапептидов, обладающих более высо- 1кой активностью как агонисты LH-RH. Пример 1. 160 мг Boc-d-nal ::(2)-Leu-Arg-Pro-Gly-NHj растворяют ;в 3 мл трифторуксусной кислоты в 140-миллиметровой трубке для центри- 1фугирования (d-nal(2) - .(2-нафтил)- -D-Ala-). Гомогенный раствор обра- батывают 35 мл абсолютного эфира и центрифугируют полученный в резуль- :тате осадок. Декантируют всплывающий слой и .повторно суспендируют осадок Б 40 мл эфира, а затем повторно центрифугируют. Полученный в резуль- тате всплывающий слой декантируют, тщательно сушат осадок, полученный в трубке для центрифугирования, делая ЭТО в вакууме;, получая при этом лишенный защитных групп на С-окончании пентапептид в виде белого порошка. Затем 162 мг (0,24 ммоль, 20%-ный избыток) Pyt;o-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH и 65 мг (0,48 ммоль, 100%-ный избы- ток) бензотриазола растворяют в 3 мл редистиллированкого диметилформамида (ДМФ) в трубке для центрифугирования емкостью.40 нп, и после охлаждения раствора льдом добавляют 54 мг . (0,24 ммоль) N,N -дициклогексилкарбо диим1-1да. К этой смеси добавляют лишенный защитных групп пентапептид, полученный по описанной методике, в растворе 3 мл ДМФ, содержащем 30 мкл (0,27 ммоль) п-метилморфолина, после чего реакцию осуществляют в течение 48 ч при 4 С. Исследование аналитическими методами обратной фазы в ходе жидкостной хроматографии при высоком давлении подтверждает факт полного, завершения реакции.

Реакционную смесь отфильтровывают и концентрируют в вакууме до получения масла, которое отбирают в 7 мл 0,0005 га NH4, ацетат при рН 7 очищают путем пропускания через карбокси- метил сефадексную колонну (2,.5 х 100 см), используемую в фармакологии и эллюируют при градиенте от 0,005 до 0,49т ацетатным буфером при рН 7. Выходящий из колонны поток контролируют по УФ-поглощению при длине

5

0

5

0

5

0

5

0

5

волны 280 нм, и фракции, соответствующие главному пику последнего выходя- щего раствора, анализируют аналитически с помощью жидкостной хроматографии при высоком давлении. Содержащие продукт фракции охлаждают и ли- офилизируют до получения 210 мг продукта, соответствующего PGlu-His-Trp-Ser-Tyr-d-nal(2)-Leu-Arg-Pro-Cly7NUt в виде белого порошка, eij -66°(С,ИоАс).

Продукт можно подвергнуть дальнейшей очистке посредством применения ж идкостной хроматографии при высоком давлении к препаративной обратной фазе с использованием колрнны С-18 (30 мкм, 2,5 X 100 см, Lichroprep гу е. merck) путем элю ирования раствором, содержащим 40% CHjCN, 60% воды 0,3 М аммоний ацетат, при рН 4,5.

Пример 2. 160мг Boc-d-nal (2)-Leu-Arg-Pro-Gly-Mj растворяют в 3 мл трифторуксусной кислоты в трубке для центрифугирования емко,- стью 40 мл. Снятие защитных групп и обработку осуществляют по примеру 1, После этого 157 мг (0,22 ммоль, 10- процентный избыток (пиро) Glu-His-Trp- -Ser-Tyr-NjH (полученного путем гидра зинолирования соответствующего метилового эфира) растворяют в 7 мл ре- дистиллированного диметилформамида и 0,265 мл (6,5 эквивалентов 5,4 молярного содержания) НС1/МеОН в прокаленной в печи двухгорлой колбе емкостью 50 мл. Раствор охлаждают до температуры - 25°С, после чего добавляют к нему. 36,6 мкл (31,8мг, 1,4 эквивалента) трет-бутилнитрата. Раствор перемешивают в течение 10 мин при температуре -25 С, а затем добавляют 0,165 мл (1,5 ммоль) п-метилморфолина (до получения (рН 7,5). К этой смеси добавляют раствор лишенного защитных групп пентапептида, полученного по указанной методике, и 4 мл ДМФ, содержащего 30 мкл п-метилморфолина. Затем рН раствора изменяют ,5 и проводят реакцию в течение 3 ч при температуре -20 С, а затем в течение 48 ч при температуре 4 С. Анализ на базе жидкостной хроматографии при высоком давлении подтвердил окончание реакции.

Реакционную смесь отфильтровыва- ют и концентрируют до получения масла в вакууме, после этого чистят посредством ионообменной.хроматографии

на карбоксиметильной сефадексной ко- лонне по примеру 1. Фракции собирают и лиофилизируют, получают 195 мг продукта, соответствующего pGlu-His-Trp- -Ser-Tyr-d-nal(2)-Leu-Arg-Pro-Gly- -№Ц в виде беловатого порошка, ег -62° (С,НоАс).

Полученный таким образом продукт подвергают дальнейшей очистке с не- ю пользованием препаративной жидкостной хроматографии с обращенными фазами при высоком давлении с применением колонки С-18, как описано в примере 1.

Пример 3. В условиях примера 15 (пиро)-Глютамин-гистизиологический раствор, содержащий BSA) не показывала никакого подавления эструса. Величины ЕДдд для объединенных групп с частичным и полным подавлением эструса составляют следующие:

Соединение: ВДбо

мкг/инъекц.

(пиро)-Глютамил-гистидил- -триптофил-серил-тиро- зил-3-(2-нафтил)-Д-ала- нил-лейцил-аргинил-про- лил-глицин-ЫН 0,ОА

2 путем конденсации двух пятичленных фрагментов: (пиро) Glu-His-Trp-Ser- -Tyr-N, и Н-3-(2-нафтил)В-А1а-Ьеи- -Arg-Pro-Aza-Gly-NHj получают дека- пептид (пиро)С1и-Н1з-Тгр-5ег-Туг-3- -(2-нафтил)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Aza Gly NHj, который выделяют в свободном виде или в виде соли, oi -34,3(,34 АсОН),

0,06

дил-триптофил-серил- -тирозил-3-(2-нафтил)- -Д-аланил-лейцил-арги- нил-пролил-азаглицин20 -NHa

Известное соединение d-Trp -LHRH0,08

Сопоставительный анализ показывает, что предлагаемые соединения в Аминокислотный анализ: Ser 0,74(1),25 1,5-2 раза активнее известного, Glu 0,89(1), Pro 0,94(1), Leu О,98(1), Определяют токсичность описываа15И

Туг 1,00(1), His 1,03(1), Try 1,01(1 Arg 0,99(1), Nal (2), 1,08(1) NH, 1,13(1).

Проведены биологические испытания описываемьк декапептидов.

Самок крыс (Hilltop, Spragrie, Dauley приблизительно 220 г с открытыми влагалищами) взвешивают сгруппированными по 5 на клетку и 2 клетки на группу. Крыс инъецируют подкожно два раза в день (за исключением указанного ниже) в течение 14 дней.

Ежедневно берут мазки из влагалища для определения стадии цикла течки и регистрируют вес т.ела в 0,1 и 2 недели. Регистрируют процент самок показывающих частичное подавление течки (т.е. только диэструс и про- эструс, но не эструс), с 4-го дня и процент самок, показывающих полное подавление экструса (т.е. только диэструс), с 3-го дня. Величины ЕД выводятся из прямой линии зависимости процентных данных подавления эструса. LHPH аналоги назначались в виде их ацетатных солей в физиологическом солевом растворе, содержащем 0,1% альбумина бычьей сыворотки. Объем инъекции составлял 0,2 мл и аналог присутствовал в дозе 0,05, 0,1; 0,2 или 0,4 мкг. Контрольная группа (фи- ВНИИПИ Заказ 4870/59

0,06

мьгх соединений.

Шесть мьш1ей Swiss-Webster (Сомон- сен), каждая весом около 25 гр, инъецировались подкожно 0,25 мл водного . раствора 3-( 2-нафтил)-d-Ala 6-L HRH в виде его ацетатной соли.-Доза 40 мг/кг или около 1 мг/мышь. Мышей наблюдали два раза в день на смертность в течение 21 дня. Летальных эффектов не наблюдалЪсь. Величина составляла, следовательно, более 40 мг/кг.

40

Формула изобретения

Способ получения декапептидов об- щей формулы I (пиро) Glu-His-Trp-Ser- 45 -Туг-3-(2-нафтил)-D-Ala-Leu-Arg-Pro- -Z,

где Z - Gly NHj, Aza Gly NH

г

или их фармацевтически приемлемых солей, отличающийся тем, gA что пентапептид, соответствующий одному фрагменту соединения I, вводят во взаимодействие с пентапептидом, соответствующим другому фрагменту соединения I, в требуемой последовательности и целевой продукт .вьщеля- ют в свободном виде или в виде фарма- цевтически приемлемых солей. Тираж 348 Подписное

55