Способ обработки содержащей полисахарид культуральной жидкости ХаNтномоNаS самреSтRIS Советский патент 1988 года по МПК C12N1/02 C12P19/06 C12P19/06 C12R1/64 

i Изобретение относится к биотехно- :логии и касается обработки водного jраствора гетерополисахарида, который :может быть использован в процессах вторичного и третичного извлечения нефти.

Цель изобретения - повышение качества обработки за счет улучшения физико-химических свойств раствора. ; Растворы полисахаридов, представ- )ляющие собой гидрофильные коллоиды, I получают в результате ферментации I бактерий вида Xanthomonas campestris j на углеводном сырье. Пригодные для (использования с этой целью углеводы- ; глюкоза, сахароза, фру1стоза, мальтоза, лактоза,крахмал.Сбраживание углевода осуществляется, как правило, в водной среде, содержащей до 100 г/л углево- да. Среда брожения может, кроме того, содержать источник фосфора, источник магния, который является активатором энзимов, и источник азота, который может быть органического, минерального или смешанного, органоминерально- гоJпроисхождения.

В результате процесса брожения и производства полисахарида культураль- ная жидкость (сусло) обычно содержит примерно 15-50 г/л полимера, а также различные составляющие, включая клетки бактерий, клеточные остатки, остаточные протеины, и минеральные ионы.

Биополимер может быть извлечен из сусла посредством осаждения с помощью агента осаждения, например изопропа- нола, фильтрации и сушки.

Способ согласно изобретению можно применять к растворам, полученным ПОсредством разведения коммерческого биополимера в порошке, однако наиболее целесообразной с целью дальнейшего применения для извлечения нефти . использовать культуральную жидкость.

Содержащий мутаназу энзим добавляют к водному раствору, содержащему 0,15 - 30 мас.% полисахарида, и смесь вьщерживают при перемешивании или без

него при температуре от температуры окружающей среды до 60 С, предпочтительно 25 - 55°С, в т(ачение 4 - 24 ч и более при рН 3,5-7. Целесообразно установить рН равным 4-5,8 посредством добавления минеральной или органической кислоты, например серной, фосфорной, азотной, уксусной, муравьиной .

д 0 5

0

Q 5

0

5

Если подлежащий обработке раствор приготовлен-из выделенного из бро- . дильного сусла порошок, целесообразно, чтобы концентрация полисахарида была 0,25-1,5%.

Если обрабатьшают цельное бродильное сусло, концентрация полисахарида, как правило, составляет 1,5-20 мас.%. Цельное сусло может быть продуктом, непосредственно полученным в результате брожения, в этом случае концентрация составляет 1,5-5%. Или это может быть сусло, сконцентрированное традиционными методами до содержания полисахарида, примерно 20%.

Способ обработки растворов полисахаридов включает энзиматическую обработку и заключается во введении в контакт этих растворов с эффективным количеством сложного энзима, содержащего мутанозу.

Мутанозы представляют ceMejiCTBo энзимов, главное общее свойство которых заключается в их способности воздействовать на 1 , 3-глюкозидные связи в положении альфа. Мутаназы получают посредством культивации соответствую- пщх микроорганизмов на среде, основным источником, углерода которой является мутан, вьщеляемый каким-либо стрептоккоком, например Streptococcus mutans СВ S № 350-71. Микроорганизмы, гене рирующие мутаназы, это Tri- choderma hargi arauni,Peni ci Ilium f uni- culosum, Penicillium melinii, Peni- ciIlium janthinellum.

Содержащий мутаназу продукт, кото рый предпочтительно используется в предлагаемом способе, получают из Trichoderma hargianum. Культивацию Trichoderma hargianum осуществляют с целью получения oi -1,3-глюконазы (мутаназы) , способной гидролизовать ci - 1,3 глюкан.

В ходе энзиматических микробных

с

брожений в отсутствие особых-опти- . мальных условий получают .несколько родственных энзиматических составляющих при сравнительно постоянных соотношениях. Промьпаленный продукт, который используется согласно изобретению, продается под торговой маркой Новозим 234 фирмой Novo Industri A./S. Этот энзим проявляет, помимо главной матаназной активности, целлу- лазную, ламинариназную, ксиланазную, хатиназную и проте1 на: 1ную активность.

Количество сложного энзима.

ляемого к водному раствору, должно быть достаточным для обеспечения разложения нерастворимых полисахаридов. и бактериальных клеточных остатков.

Это количество одновременно зависит от знзиматической активности комплекса, от содержания в подлежащем обработке растворе нерастворимых ве- ществ и от условий энзиматической обработки.

При использовании комплекса Ново- зим 234 о.бычно достаточно количества 0,1-3 мас.% по отношению к массе ксантеновой смолы. , Рациональное количество может также быть расчитано по отношению к азоту, содержащемуся в среде и исходящему главным образом- из биомассы. -Энзима V-в количестве 20150 г, предпочтительно 40-100 г, на 100 г азота, как правило, достаточно для разрушения и бактериальных остатков, и нерастворимых веществ небактериального происхождения.

Энзиматическую обработку можно . также проводить с растворами полисахаридов, которые предварительно ос-с ветлены известными методами, например

посредством пастеризации, центрифуги- JQ патронами, в которых полимер может

рования, фильтрации через диатомные земли и т.д.

Раствор полисахарида, который j, представляет собой цельное бродильное сусло, до энзиматической обработки подвергается нагреванию до 60 - 150° С в течение от 5 мин до 2ч. Установлено, что сочетание термической обработки с энзиматической обработкой приводит к заметному осветлению растворов ксантановой смолы. Лучшие результаты с точки зрения свойств агента вязкости, ф mьтpyeмocти и впрыскиваемости получены с помощью . термической обработки бродильного сусла при рН 3,5 - 6,2, предпочтительно 4 - 5,5, при температуре 60-110 С, предпочтительно 80-100 С, в течение 5-60 мин, предпочтительно 15-30 мин, за которой следует обработка комплексным энзимом.

Получаемые в результате знзиматической обработки растворы гетерополи-. сахаридов, а также выделенные из этих растворов порошки могут быть использованы зо всех случаях, когда требуются осветленные продукты, например при вторичном и третичном извлечении нефти.

35

40

45

50

55

быть подвержен высоким градиентам скорости (1000 10000 ),значительно снижающим реальную вязкость продукта, что позволяет осуществит : быструю транспортировку в промышлен I ньгх аппаратах с большой поверхность (10-50 м ) и улучшенный перенос. Дл данного процесса можно использовать мембранные фильтры, например, из це люлозы, полиамида, полибензимидазол акрилового сополимера, полиакрилони рила, полисульфона, полифторида ви- нилидена, сложных комплексных полиэлектролитов , пороги фильтрации кот рых 10-100000,

Расход зависит от температуры, д ления, скорости прохождения, а такж от вязкости и концентрации биополим ра и составляет 5-50 лДч м)при лин ной скорости 0,5-5 м/с. Температура может быть от температуры окрл,гжающе среды до 80 С, давление - порядка 1 15 бар, предпочтительно 1-6 бар.

Обычно ультрафильтрация позволяе получить концентрацию 70-180 г биоп лимера на 1 кг сусла. Если сложный энзим добавляют до ультрафильтрации энзиматическая реакция продо.тжается во время фазы концентрации полимера

29938

-

Q 15 20 25

Слабоконцентрированный раствор экономически невыгодно транспортировать. При испльзовании полимера в порошке возникает проблема повторного растворения на мес те пользования, В определенных случаях целесообразно производить концентрирование раствора биополи 5ера. Концентрация может быть осуществлена с помощью традиционных приемов, например выпаривания или ультрафильтрации, Последни :: метод является предпочтительным, так как он более экономичен и позволяет разделять в промьшшенных условиях молекулы с низким и высоким молекулярным весом и концентрировать полимеры без изменения их реологических свойств. Установлено-, что ультрафильтрация даже при высоком градиенте скорости не изменяет свойств агента вязкости ифиль- труемости растворов.

Концентрация путем ультрафштьтра- ции может осуществляться с использованием известных технологий и оборудова- . ния, например с помощью аппаратов с фильтровальными патронами, спиралями, тру- бами. Предпочтительно использовать аппараты с рифленными фильтровальными

5

0

5

0

5

быть подвержен высоким градиентам скорости (1000 10000 ),значительно снижающим реальную вязкость продукта, что позволяет осуществить : быструю транспортировку в промышлен- I ньгх аппаратах с большой поверхностью (10-50 м ) и улучшенный перенос. Для данного процесса можно использовать мембранные фильтры, например, из целлюлозы, полиамида, полибензимидазола, акрилового сополимера, полиакрилонит- рила, полисульфона, полифторида ви- нилидена, сложных комплексных полиэлектролитов , пороги фильтрации которых 10-100000,

Расход зависит от температуры, давления, скорости прохождения, а также от вязкости и концентрации биополимера и составляет 5-50 лДч м)при линейной скорости 0,5-5 м/с. Температура может быть от температуры окрл,гжающей среды до 80 С, давление - порядка 1- 15 бар, предпочтительно 1-6 бар.

Обычно ультрафильтрация позволяет получить концентрацию 70-180 г биополимера на 1 кг сусла. Если сложный энзим добавляют до ультрафильтрации, энзиматическая реакция продо.тжается во время фазы концентрации полимера.

5.14

Возможна очистка раствора полисахарида с помощью диафилБтрации пос-- редством постоянного или периодического добавления воды во время или после ультрафильтрации со скоростью, Е значительной мере соответствующей скорости отбора ультрафильтрата. Молекулы с низкой молекулярной массой, Получаемые в результате реакции эн- (зиматического разложения, удаляются JB пермеат. Очищенный таким образом Продукт обладает улучшенными свойствами по вязкости.

Термическая обработка в кислой .среде в сочетании с энзимат1гческой обработкой позволяет улучшить показа- тели ультрафильтрации по сравнению с необработаннь 1М термически суслом . ;.или с суслом, которов подвергнуто об- ;работке в условиях нейтрального или щелочного рН, В частности, при той же поте ;ре напряжения на контактах ультра- . (фильтрата термическая обработка в ;кислой среде позволяет получить более Концентрированные растворы биополиме- ipa прп более значительных расходах {питания. Таким образом, можно полу-г чить концентрацию 200 и даже 300 г па . 1 кг сусла.

Пример 1. Используют бродильное сусло с содержанием ксантено- вой смолы 8 г/л, полученное в результате брожения Xanthomonas cam- :pestris.

Одну фракцию сусла концентрируют Посредством ультрафильтрации, исполь- ; эуя прибор UFP 0, снабженный мембранными патронами 1 RIS 3038 (торговые марки инофирмы до концентрации i кг сусла.

Устанавливают рН второй фракции 5,5, добавляя концентрированную серную кислоту, затем эту фракцию нагре- ВЕЮТ до в течение 5 мин. После охлаждения сусло концентрируют ультрафильтрацией, как и первую фракцию, до концентрации 112 г/кг.

К 1 кг каждой фракции концентрированного сусла добавляют 1,1 г Новози- ма 234 (торговая марка фирмы Novo Industri A/S). Смесь выдерживают 14 ч при 30 С при перемешивании, затем охлаждают до температуры окружающей ере Ды.

Дня обработанного таким образом сусла определяют вязкость раствора с

Рон Пуленк Решерш), 1 12 г биополит-iepa на

f

концентрацией ксантановой смолы 1000 М.Д., содержащего 5 г/л NaCl, а также мутность раствора при 1000 м.д.

Измерения вязкости осуществляется с помощью вискозиметра Брукфилда, . снабженного приставкой UL, при 25 С для степени сдвига 7,3 .

Мутность определяют посредством измерения оптической плотности при 650 нм для оптического пути 4 см.

Результаты представлены в табл.1.

Обработано Новозимом 234 без термическойобработки 42,5 0,4|5

Обработано при 100°С, рН 3,5, затем обработано Новозимом 234 63, 1 О , 144

Обработано при

, рН 5,5

не обработано

(контроль) 59,5 0,749

Пример 2. Используют бро- диль ное сусло, содержащее 80 г ксантановой смолы на 1 кг сусла,которое сконцентрировано непрерьшным способом с помощью ультрафильтрацки из неочищенного сусла с концентрацией 15,6 к/кг, обработанного при рН 5,5 в течение 15 мин при , и без термической обработки.

К 1 кг концентрированного сусла добавляют 1 г Новозима 234. Смесь выдерживают 14 ч при 40 С при перемешивании, затем охла}ада от до температуры окружающей среды.

Эффективность обработки относи- , тельно способности к фнльтруемости и впрыскиваёмости опреде.пяется по тестам, которые описаны ниже, в сравнении с таким же суслом, не. подверженным эн- зиматической обработке.

Результаты прехиг.тавлены в табл.2,

,Т а б л

а 2

Изобретение относится к биотехнологии и касается обработки водного раствора .гетерополисахарида,который может быть использован в процессах вторичного и третичного извлечения нефти. Целью изобретения является по- вьшение качества обработки за счет улучшения физико-хиьшческих свойств раствора. Способ заключается в oм, что культуральную жидкость Xanthomo- nas campestris подвергают энзимоти- ческой обработке препаратом Новозим 234, который содержит сбалансированное соотношение различных видов гидролитических ферментов. При этом перед введением ферментного препарата культуральную жидкость предварительно; -прогревают. Полученный раствор обладает лучшими фильтруемостью, прозрачностью и впрыскиваемостью. 5 табл. g

Да

5028,4

(83 мл)

Her

Нет

Засорение

Испытание истечения или фильтруе- мости с постоянным расходом позволяет установить явление засорения, которое может проявиться при впрыскивании разведенного раствора биополимера в залежи нефти и, следовательно, измерить пригодность раствора биополимера для применения в ходе сопутствующего извлечения нефти.

Принцип этого испытания заключается в том, что растворы с постоянным pacxoдo 4 пропускают через калиброванный фильтр. Потеря давления ( йР) на контактах фильтра, вызванная прохождением раствора биополимера, характеризует пригодность к фильтрации

Для соблюдения условий, имеющихся в месте применения, растворы испытывают . , с одинаковой вязкостью (а не с одинаковой концентрацией).

Испытания осуществляют в следующих условиях: температура 30°С, расход 22,5 мл/ч; фильтры марки Milli- роге диаметром 47 мм, с диаметром пор 3, 8 и 12 мкм.

Приготовлез1ие растворов. Сусло разводится в содержащей соли воде (50 г/л NaCl и 5 г/л СаС,) так, чтобы полученный раствор имел вяз- . кость 35 мПа-с (измеряется вискозо- метром Брукфилда с пристг.вкой UL при , степень сдвига 7,3 с.

Потеря давления ДР измеряется, когда 350 ьш раствора оказьтагзтся отфильтрованными. Если давление превышает 50 мбар, число в скобках указывает объем раствора, который был профильтрован при достижении давления 50 мбар..

(О,10 мл)

10 мня 10 tEKH iO MitH 48 с0,390

() (450кп) (740 ш)

Засоренпе0,860

Испытание впрыскивания при постоянном давлении позволяет установить свойства впрыскиваемости разведенных растворов биополимера. Принцип заключается в том, что растворы под постоянным давлением пропускают через калиброванный фильтр. Истекающий в зависимости от времени объем характеризует впрыскиваемость.

Испытание проводят в следующих условиях: фильтры марки Millipore диаметром 47 мм с диаметром пор 0,8- 8 мкм; давление 3 бар, приготовление растворов идентично приготовлению растворов в испытании на фильтруемость с постоянным расходом. Вязкость равна 35 мПа-с (Брукфилд с приставкой UL, 7,2с- )..

Фиксируют время, израсходованное на протекание 000 ьш раствора. Если это время превосходит 10 мин, величина в скобках указьшает объем раствора, который был профильтрован.

П р и,-М е р 3. Влияние энзимати-: ческой обработки на впрыскиваемость разведенных растворов, полученных из порошка ксантановой смолы, который был осажден из обработанного сусла.

Из сусла, обработанного Новозимом . 234 по примеру 2, вьзделяют биополимер посредством осаждения с помощью изо- пропанола. Волокна промывают, сушат и перемальшают.

Для сравнения биополимер выделяют из фракции того же сусла, но до знзи- матической обрегботки,

-

Разводят 5 г порошка водой, содержащей соли, с помощью смесителя марки

Warnip Blender так, чтобы вязкость nony ienHoro растпора была равна 35 , а концентрация солей 50 г/л KaCl н 5 г/л CaClj.

Испытуемый раствор

Волокна необработанного сусла

Волокна сусла, обработанного Новозимом 234

ПримерА. 20 кг бродильного сусла, содержащего 15,6 г ксантеновой смолы на 1 кг смолы, термически обрабатывают в течение 15 мин при 100 С рН 5,5.

К 5 кг обработанного и охлажденног го до 40 С сусла добавляют 1 г Ново- зим 234 и вьщерживают раствор в течение 10 ч при 40°С. Сусло затем концентрируют посредством ультрафильтрации на UFP 2 (торговая марка фирмы Рои-Пуленк Решерш), снабженной мембранными .фильтрами IRIS 3038 А из ак- рилонитрила с фильтрующей поверхностью 0,022 м . Сусло концентрируется до содержания 80 г на 1 кг сусла.

Отбирают 100 г сусла для испытания на впрыскиваемосТь при постоянном расходе.

Каждый из этих растворов подверга- ется тесту впрыскивания при постоянном давлении, описанному в предыдущем примере. Результаты представлены в табл.3.

Таблица 3

Впрыск1шаемость при постоянном давлении 3 бар - время для прохождения 1000 мл раствора с 35 мПа-с через приоритетные фильтры, мкм

10 мин 10 мин

30 с

(220 мл) (905 мл)

1 мин 52 с

32 с

19 с

(580 мл)

Оставшееся сусло промьшают известным способом (диафильтрация) при 55 С проточной водой в количестве, в 5 раз превьш1ающем вес сусла, на том же аппарате, а затем вновь концентрируют до 80 г/кг. По мере промывки конечная концентрация азота в оставщем- ся веществе уменьшается, достигая в конце операции 20% от начального содержания .

- Результаты теста на впрыскивае- мость с постоянным расходом представлены в табл, 4 в сравнении с суслом, которое концентрировалось посредством ультрафильтрации без термической обработки и без знзИматической обработки (контрольная проба).

Концентрация на UF

815 35 50 44

(22,5 мл)

Обработано Нрвозимом

234, концентрация на

Обработано Новозимом 234, концентрация на UF-, диафильтрация

П р и м е р 5, Для определения эф

фективности комплексного ферментного препарата Новозим 234 по сравнению с ферментным препаратом Киталазя используется ксантановая смола Кильзан. Ксантановую смолу разводят в воде, содержащей соли, педемешивая при для получения ксантанового раствора 6000 ч. на млн. Добавляют 25 ч. на млн Алкалазы или 25 ч. на млн Но- возима 234. Раствор, содержащий Новозим доводится до рН 6 (рН, способст- вующий ферментной активности). Каждая смесь перемешивается при 25 С в течение 4ч.

Не обработанный со сдвигом без сдвига

Обработанный Алкалас

со сдвигом 0,030 1100 3,7 3,15 без сдвига 0,033 540 3,5 3,15

Таблица 4

35,3 37

12,1 1.7

37,2 35,1

11,4 1,8

В конце обработки часть растворов подвергают усилиям сдвига в соплах при Р порядка 30 бар. Каждый образец разбавляют водой USBR для ксантановой концентрации 300 «i. на млн. Измеряют оптическую плотность, Фильтруемость определяется на фильтре 1,2 мм путем измерения количества раствора, отфильтрованного на 5 мин при давлении 1,4 бар. Вязкость измеряется прибором Брукфилда.

Результаты испытаний представлены в табл.5..

200 120

3,6

3,5

3,2 3,2

Ф ормула изобретения

Способ обработки содержащей поли- сахарид культуральной жидкости Xaлtho mpnas campefetris, предусматривающий вйедение в нее комплексного фермент- Hijjro препарата, обладающего целлюло- зблитической,,3-глюконазной и . п|)отеазной активностями, с последую- imjiM инкубированием, отличаю - и с я тем, что, с целью повьше- нйя качества обработки за счет улуч- ш4ния физико-химических свойств раст-

вора, в качестве комплексного фер-.. ментного препарата используют Ново- зим 234, обладающий дополнительно ,3-глюконазной активностью, кото- рый вводят в количестве 0,1-3 .мас.% в расчете на 0,15-30 мас.% полисахарида культуральной жидкости, при этом инкубирование осуществляют при 30-60 С в течение 4-14 ч, а перед введением ферментного перпарата на культуральную жидкость предварительно прогревают при 60-100 С в течение 5-60 мин и устанавливают при3,5-6,2.