Способ получения антибиотика 17.967 Советский патент 1977 года по МПК C12D9/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕПИЯ АНТИБИОТИКА 87.967 RP Агар Треспера коричнева- Серо-ро Суб.. Хорошее н Хйкея (А) го-желтый Субсфатньй, жс)тто-коАгар (В)Тоже рршевыш Субс1рагиьш желто-коAiap с дрожжевым экстргж- ркчневый том Пр{щхема Субстрйтиьш, желто-коОвсяный агар ричиевый с томалюй пас- - ток Прядхема (С) ГлгокозопептоСубстратный, коричнево новьш агар (Wj) -/черньга

Вегетативньш, коричневоУмерсппоежелтый, умеренно-развитый

Среднее

BereTaiiiBiabni, черный

Вегетагивньнз, беснвегннн

Умеренное желтоватьЕЙ. умерешю развитый

Умеренное

Субстратный, оранжево-ко-Серовато-желтый, ркчневый с KopirresBo- слегка розовый, чернымслабо развитый Глюкозоаспар- Хорошее Субстрзтщцй, коричневопшовьй агар «врньш (W,j Глицеряноас- Хорошее Субстратный, коритеевопаргановьаоранжевьш (№з) но разв

Нет

Коричнево- желтый

Черный, обильный Образование мелапродуцируется ера- шша: положигель зу в начале культа- вое вировання

Растворимость малата кальция; растворяется, но медленно

Черный достаточно обильный овый, силь- Желто-коричневый.Споры овальные, размером 0,4-0,6 и переходящий в тьи черный 0,Ъ-0.8Aii °P носцы образуют спирали и располагаются в виде коротких гроздьев озовато-серый, свет- Желто-коричневый, лый, развитый переходтций в черный Розовато-серый, хо- Желто-коричневый, рошо раэви1Ъ1Й почти коричневый Белый с розово-се- Темно-коричневый, рым, хорошо развитыйСероватый, умерен- Черный, обильный но развитый Серовато-розовый, Коричнево-черный умеренно развитый Серо белый с сероКоричнево- оранжевый, переходящий розовым, весьма умеренно развитый в коричнево- черный

Хорошее Субстратный, коричнево- Розово-сероватый, желтыйхорошо развитый Весьма Субстратиый, желтоватый Агар с крахмаумеренное со светло-коринневым лом и нитратом (W,o) Хорошее Субстратный, цвета красСинтетическийагар Гаузе (Н) ного дерева с коричневым, переходящий в коричневочерныйСинтетический То же Вегетативный оричневоагар Чапека с желтый сахарозой (Wi) Синтетический Вегетативный, коричневоагар Чапека с желтый, светлый с темноглюкозой (1) коричневым, очень хорошо развитый.

Среднее Покров достаточно хоро- Беловатый весьма шо развитый, субстратный,умеренно развитый желто-коричневый .

Бульон Чапека Умеренное Развивается в виде с сахарозой (Wi g)беловатых хлопьев

на поверхности я оседает

Серо-коричневатый. Споры овальные рю слабыймером 0,4-0,6 и

0,6-0,8м, спороносцы образуют спирали и располагаются в виде коротких гроздьев крахмала, гидролиз продолжительный

Гидроли з крахмала положительный

Коркчяево-желты Реакция на нитриты положительнжя

ет

НетРеакция на нитриты

слабо положительная 8 начале культивировання, делается очень быстро отрицатель.ной

Утилизация делкшозы отрнпдтельная

ет

Темно-коричневый Реакция на нитриты отрицательная в ходе культивирование; пробы брались соответственно черлз 24 час,48 час, 8 дней, 15 дней и 1 мес. куль тявирования Белый с серовато-бе- Коричневатый дым, умеренно ра Бело-розовый до се- Черный глубокий ровато-розового, хороию развитый Серовато-бепый со Темно-коричневый светлым сероватожелть1м, умеренно развитый Пигмент коричвенево-оранжевый

Вегетативный, черный,Нет

Агар Треснера То же

хорошо развитый и Данга (М)

Хорошо развитьшНет -//-

венчик

Очень хорошо развитыйНет

Очень

венчик, коричнево-желхорошеетый

Образование Hj S. положительно

Полная пептониздция без коагуляции, рН не меняется в течение месяца

Полная пептоанзацня без коагуляции , рН не мевсяется в течение

месяца

Антибиотик 17.967 RP растворим в диметилформамиде, мало растворим в пиридине, ацетоне, метаноле и воде, нерастворим в эфире, циклогексане и гексане. Антибиотик 17.967 RP содержит углерод, водород, кислород и азот. Его элементарный состав,%: С - 61,5; Н - 5,25; О - 20,0; N-12,5. Антибиотик представляет собой микрокристаллический желтый порошок. Точка плавления 290-300° С (сразложешем). УФ - спектр. (раствор в диметилформамиде, концентрация10,5 кг/лJ Максимум поглощения при 268 нм, Минимум поглощения при 285 нмЕ}%, Максимум поглощения при 368 нм В растворе дйметилфор мамида его оптическое вращение равно а ° -1-103 ° (,5). Способ получения антибиотика П.967 RP состоит в культивировании Streptomyces roseopullatos DS штамм 20.073 или его мутантов на среде в соответствующих условиях и выделении образовав3540 45 50 |55 60 шегося в процессе культивирования продукта. Культивирование осуществляют любым методом аэробного культивирования, поверхностного или глубинного, но предпочитают глубинное. Среда для ферментации должна содержать источники ассимилируемых азота и углерода, минеральные вещества и иногда факторы роста, причем все эти компоненты вводят в виде отдельных веществ или в виде сложных смесей. В качестве источника ассимилируемого углерода используют такие соединения углерода как глюкоза, мальтоза, декетрин, крахмал или другие органические вещества, например, спирты, глицерин, манонитол или органические кислоты (молочную, лимонную). Некоторые животные и растительные жиры, например, свиной жир или соевое масло, могут заменить эти источники углерода или дополнить их. Источниками ассимилируемого азота могут быть минеральные или органические соли аммония, мочевина, некоторые аминокислоты, а также сложные вещества, содержащие азот, главным образом, в белковой форме: казеин, лактальбумин, глютен и их гидролизаты, соевая, арахисовая, рыбная мука, дрожжевой, мясной зкстракты, кукуруза, растворимые мелассы. Добавляют также минеральные вещества, которые обладают буферным или нейтрализующим действием, например фосфаты щелочньк или щелочноземельных металлов И7ш карбонаты кальция н магния.

Хлориды и сульфаты щелочных и щелочноземельных металлов обеспетивают ионное равновесие, необходимое для развития Streptomyces roseopullatus штамм DS 20.073 и образования антибиотика.

Соли цинка, меди, кобальта, марганца действуют как активаторы.

рН ферментационной среды в начале культивирования должно быть в пределах 6,0-7,8, предпочтительно 6,5 - 7,5. Температура ферментации 25-30° С. Аэрация 0,3-3 л воздуха на 1 л бульона в 1 мин. Максимальный выход антибиотика 17.967 RP получают через 2-8 дней купьтивирования.

Антибиотик п.961 RP выделяют из сусла растворителями, несмещивашщимися с водой, такими как алифатические спирты, например этилацетат, хлорированные растворители, например дихлорэтан, хлористый метилен или хлороформ.

После фильтрования и декантации сырой продукт выделяют из органических растворов концентрированием зтих растворов при пониженном давлении и последующим высаждением каким-либо растгворителем, совсем нерастворяющим вещество или плохо его растворяющим, например гексаном. Грязный антибиотик очищают перекристаллизацией или хроматографией на различных адсорбентах. Методы экстракции, выделения и очистки антибиотика могут быть повторены многократно с целью выделения этого продукта в форме, пригодной к употреблению.

Пример. В ферментер емкостью 350 л загружают 5 кг кукурузы (50%-ный сухой экстракт); 7,5 кг крахмала (частично гидролизованного) водопроводную воду добавляют до 220 л, рН доводят до 6,85 450 мл 0 Н соды. Среду стерлиэуют барбатированием пара температуры 122° С в течение 40 мин. После охлаждения объем бульона 250 л И рН6,85. Затем засеивают 200 мл культивированного в колбе Эрлекмейера с перемешиванием Streptomyces roseopullatos щтамм DS 20.073

Культура развивается при перемехиивании и аэрации стерильным воздухом при 27° С в течение 27 час. После этого она становится пригодной для засеивания с целью получения антибиотика.

Получение антибиотика производят в ферментере емкостью 800 л, загруженном следующими веществами:

Растворимые мелассы, кг7,5

Кукуруза ( сухой экстракт), кг 10

Соевое масло, л.10

Хлорид кобальта гексагидрат, гШ

Водопроводная вода добавляется до, л 450

рН доводится до 7,25 с помощью 1800 мл 10 Нсодыузатем добавляют 2,5 кг карбоната кальция.

Стерлизуют среду барботированием пара температуры 122° С в течение 40 мин. После охлаждения объем бульона около 490 л. Его доводят до 500 л

добавлением 5 л стерильного водного раствора, содержащего 2,5 кг церелозы и 5 л стерильного водного раствора, содержащего 1 кг сульфата аммония. рН среды тогда становится 7,10.

Затем засевают 40 л инокулята, полученного в ферментере на 350 л как описано вьпие. Культивирование проводят при 27° С в течение 138 ч при перемеишвашж с помощью турбины, делающей 175 об/мни и аэрации пропусканием стерильного возпуха со скоростью 20 м- час, рН среды становит. ся 7,40. а объем сусла 450 л. Количество антибиотика 27 ед/см.

При мер 2. 450 л сусла для ферментации, полученного в условиях примера и имеющего титр 27 едУсм, помещают в чан, спабжепньп перемешивающим устройством. рН сусла доводят до 7200 см 5 Н соляной кислотой. Добавляют затем 400 л этилацетата н перемепшвают 1 час. Затем добавляют 50 кт вспомогательного агента для фильтрования и суспензию фильтруют на фильтре под давлением. Осадок промывают 00 п этилацетата, а затем 100 л воды. Фильтрат и промывные воды, объе.м которых 1000 ;i, декантируются. ОргаШ1ческую фазу отделяют, ее объем 390 л. Нижний водный слой, объем которого 610 л, отбрасьпзают. органический экстракт промывают 100 л воды м промытый экстракт отделяют от волною слоя.

Промытьш орган 1ческий экстракт конпентрируют при пониженном давле}П1м (70 мм Н д) при 27°С по объема 3 л.

Концентрат разбавляют 30 л гексзна. Антибиотик высаживают, отделяют фильтрованием, промывают гексаном и сушаг при40 С при пониженном давлении (5 мм Нд). Получают таким образом 3 1 г гряз}гого 17.967 RP, имеюи1его активность 244 ед/мг

П р и м е р 3. 47 г продукта, полученного, как описано в примере 2. растворяют при перемешивашш в 1 л диметилформамида. Полученный раство

фильтруют. Затем медлепно добавляют при перемешивании в течение 4 час 1,5 л смеси метанол-вода (50-50 об.%), чтобы вызвать кристаллиэащiю 17.967 RP. Кристаллы фильт 5уют, промывают смесью 0.3 л метанол-вода (50-50 об.%) и 0,2 л ацетона, затем высушивают в течение 15 час при50°С в вакууме (5 мм Нд). Получают 8,7 г кристаллического продукта, имеющего активность 600 ед/мг.

П р и м е р 4. 8,4 г продукта, полученного по примеру 3, растворяют при перемешивании в 250 м диметилформам1 да. Получепньп раствор наносят на хроматографическую колонку, содержащую 120 г силикагеля Мерка, пропитанного смесью д 1метилформамид-ацетон (50-50 об.л). Силикагель промывают 500 мл смеси диметилформамида-ацетон (50-50 об.%). К фрак1ши. окрашемпой в желтый цвет (прибдизителы о 500 мл, содержащей 17.967 RP), добавляют 5(Ю м.п смеси метанол-вода (50-50 об.,), которая выз1,1иает кристаллизацию 17.967 RP. Кристаллы фильтруют, промывают 150 мл смеси метанол-вола (50 5{))и 100 мл .-. .,.., V . i 41 A ацетона. Проду1ст высуцхивают в ujjeHne 15 час, при 50°С в вакууме (5 мм Н д). Таким образом получают 5,74 г 17.967 RP, имеющей активность 80 еп/мт. Г р и м е р 5, 21,7 г продукта, полученного по примеру 4, растворяют при перемешивашта в 600 мл диметилформамида. Раствор фильтруют, затем медле1шо в течение 4 час при ме;яленном перемешивашш прибавляют 1200 мл смеси ацетон-вода (50-50 об.%), чтобы вызвать кристаллизащ ю 17.967 RP, Полученные кристалль фильтруют, промывают 200 ми смеси ацетон-вода (50-50 об.%) и 200 мл ацетона, йысушивают в Te4etffle 15 час при 50° С в вакууме (5 мм Н д), затем в течение 8 час при 50°С при 0,5 мм Нд. Получают 18,2 г 17,967 RP (чистого), имеющего акдавиость 1000 еа/Кгг. (При мер 6. 20 г продукта, полученного по примеру 2, и имеющего акттзность 195 ед/мг, растворяют в смеси ацетон-диоксаи-вода (10-3-1 об.%) Полу ешаяс раствор фильтруют для отделения 6,5 г икрасгворимого осадка. К раствору добавляют 200 г снликагеля Мерка и упаривают досуха на роторе, получая 17.967 RP, нанесенный на силикагель. Готовят колонку из кг силикагеля Мерка с хлороформа ( 51 см) и помещают нанесенный на силикагель 17.967 RP на эту колонку. Элюирование проводят последовательно с помощью следующих растворителей; хлороформ-метанол-ацетон (78-20-2 об.%) 4л, ацетон 4 л. Элюагы концентрируются до объема (Ю мл. Так как в ходе кош :ен1рирова шя 17.967 RP высаживается, добавляшг 50 мл дамеишформамида, чтобы растворить этот осадок и сконцентрировать снова до 50 мл. Уедлен5ю добавляют в течение 1 час 30 мя воды, чтобы вызвать кристал/шзацию 17.967 RP. нсталлы фильтруют, промывают 20 мй да о5ссаш и высушивают в resefffle 15 час при SO°C в вакууме (5 мм Нд). Получают ,17 г 5 Ошщенного 17.967 RP, имеющего активность 925 , Антибиотик 11.967 RP обладает антибактериальной активностью по отнощению к бактериям различных видов. Он не проявляет заметной перекрестной резистенции с хромомицином, руфохромомицином и фунорубиданом и обнаруживает незначительную перекрестную резистенцию с актиномидином. Антибиотик обладает также бактериостатической активностью по отнощению к некоторым возбудителям инфекции. Кроме бактериостатической активности антибиотик обладает антиопухолевой активностью при введении его под кожу или внутрибрющинно. Эту активность определяют на опухолях, привитых мышам, таких как ; саркома 180 (тве55дая форма), асцидные клетки Эрлиха и лейкемия L 1210, при дозах в пределах 0,2 - 0,005 мг/кг. При саркоме 180 у мыщей подкожное введение дозы 0,05 мг/кг в день в течение 5 дней вызывает уменьщение веса опухолей по отнощению к весу опухолей у контрольных животных на 80%. Токсичность антибиотика определяют на мыщах при введении им дозы вещества подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно или перорально в течение 5 дней подряд. ЛДйо, определенные для подкожного введения 15,000 мг/кг, внутрибрющинного 0,055 мг/кг, внутривенного -0,150-0,175 мг/кг. Формула изобретения Способ получения антибиотика, отличающийся тем, что щтамм Streptomyces roseopul atos DS 20.073 (N-RRL 3430) культивируют в эробньгх условиях на питательной среде, содержаей источник углерода, азота, минеральные соли, с оследующим выделе шем и очисткой целевого продукта известными приемами.