Способ получения антибиотика Советский патент 1975 года по МПК C12D9/14 

4ение 27 час, при перемешивании к аэрации стерильным воздухом. После этого она пригод на для засева производящей культуры. Производящую культуру вырабатывают в 800-литровом бродильном чаке, куда помеща ют следующие ипгредкег.ты: Соевая мука 20 кг 2,500 кг Барда 10 кг Крахмал 2,500 л Соевое масло 5 кг Хлористый натрий 465 л. Вода до получения таким образом Величину рН полученной 400 см среды доводят до 7,20 с помощью концентрированного едкого натра. Среду затем стерилизуют текучим паром при 122°С в течение 40 мим. После охлаждения объем бульона составляет 500 л, а величина рН 6,75. Затем среду засевают 50 л указанной культуры в 170-литровом бродильном чане. Культуру выдерживают при 28°С в течение 67 час при взбалтывании и аэрации стерильным воздухом. Величина рН зтой среды 7,40; объем сусла 520 л. Количество присутствующего в среде антибиотика составляет 29 ед//см Пример 2. Засевают питательную среду в 170-литровом бродильном чане в тех же условиях, что и в примере I, но с помощью 200 см культуры щтамма «Streptomyces 8899, находящейся в конической колбе, которую при этом взбалтывают. Производящую культуру затем вырабатывают в 800-лит|ровом бродильном чане, загруженном таким же образом, как это указано в примере 1. Величину рН среды доводят до 8-10 с помощью концентрированного едкого натра. Затем среду стерилизуют текучим паром при 122°С в течение 40 мин. После охлаждения объем бульона составляет 500 л, а величина рН 6,80. Затем среду засевают с помощью 75 л указанной культуры в 170-литровом бродильном чане. Культуру выдерживают при 26-27°С в течение 67 час при взбалтывании и аэрации стерильным воздухом. Величина рН этой среды равна 7,40, а объем сусла 545 л. Количество присутствующего в среде антибиотика составляет 9,1 ед/см. Пример 3. Сусло, полученное как описано в примере 1 (520 л при титре 29 ед/см), помещают в чан, снабженный мещалкой. Величину рН доводят до 1,8 с помощью концентрированного раствора щавелевой кислоты. Взбалтывают в течение часа, а затем добавляют 20 кг вспомогательного материала для фильтрации. Смесь отфильтровывают на фильтр-прессе, а осадок после фильтрования промывают 100 л воды, подкисленной до рН 2 с помощью щавелевой кислоты. В фильтрат, объем которого составляет 612 л, добавляют концентрированный раствор едкого натра до тех пор, пока величина рН не достигнет 4,5. После этого фильтрат направляют на колонку, содержащую 20 л Амберлита 1RC 50 в кислотном цикле (диаметр колонки 15,2 с:.:, высота колонки 200 см, высота слон сл:олы в колонке 110 см). Фильтрат пропускают через слой Амберлита снизу вверх при расходе 40 л/час. Затем колонку промывают 100 л воды, из расчета 50 л/час, циркулирующей снизу вверх, после этого ее промывают 75 л метанола, содержащего 10% воды. Метанол циркулирует сверху вниз при расходе 50 л/час в течение полуторачасов. Удаляют промывочные воды и колонку вновь элюируют раствором следующего состава: Хлористый натрий10 г Вода100 смз Метанол до получения 1000 см. Объем элюата, который содержит большую часть антибиотика, составляет 100 л. Его концентрируют под пониженным давлением и при температуре 35°С до получения объема 10 л. Концентрат постепенно экстрагируют при рН 7,5 двумя порциями хлороформа по 5 л. Величину рП хлороформного экстракта доводят до 4 с помощью раствора уксусной кислоты в хлороформе (10: 100 по объему), затем экстракт концентрируют при 30°С под пониженным давлением до получения объема 100 см. Антибиотик осаждают добавлением 1 л гексана, центрифугируют, промывают и высущивают. Получают 9 г красного аморфного порошка с титром ,1400 ед/мг. Пример 4 17,1 г сырого продукта, полученного таким образом, как это описано в примере 3 (титр-1530 ед/мг) растворяют при взбалтывании в смеси, составленной из 1,5 л хлористого метилена, 0,3 л четыреххлористого углерода и 1,8 л воды. Величину рН доводят до 3 добавлением 8 см 1 н. соляной кислоты. После декантации водную фазу обрабатывают 7 л хлористого метилена и 200 см 0,1 н. едкого натра, чтобы довести величину рН до 7,5. Снова декантируют и экстрагируют водную фазу при рН 7,5 с помощью 3,5 л хлористого метилена. Экстракты хлористого метилена соединяют и концентрируют до 100 см. После добавления в концентрат 1 л гексана получают продукт осаждения, который отильтровывают, промывают и просущивают ри 30°С под пониженным давлением. Полуают 9,15 г антибиотика в виде красно-ораневого аморфного порошка с титром 180 ед/мг. Пример 5. Готовят смесь, состоящую из лористого метилена, четыреххлористого угерода и буферного раствора Мак Ильвэна с Н 5,8 буферного раствора (20 см этого буерного раствора приготавливают добавленим 12,09 см 0,2 м раствора двузамещенного осфата натрия Na2HPO4 к 7,91 см 0,1 м лионной кислоты (в соотношении 2:1:3, по бъему). Когда смесь приходит в равновесие, азделяют обе фазы. Растворяют 10 г продука с титром 1750 ед/мг (полученного способом, писанным в примере 4) в смеси, состоящей из л каждой фазы. Эту систему подвергают

противоточному распределению в 6 переходов в 5-литровых колбах, используя при этом тяжелую фазу ( растворитель) в качествеиодвижкой фазы, а легкую фазу (водную) - в качестве стационарной фазы. Каждый раз используют 1 л каждой фазы. Производят раздельный сбоо смеси низких (смесь Л) и высших (смесь В) фаз четырех первых колб и смесь низших (смесь С) и высших (смесь Д) фаз трех последних колб.

Величину рН сл;еси В доводят до 7,5 добавлением 300 см 1н. едкого натра, а затем производят постепенное экстрагирование смег-п четырьмя, двумя и одним литром хлороформа. Хлороформовые экстракты и смесь А соединяют и концентрируют под пониженным давлением до объема 700 см. Концентрат промывауот двумя порциями воды по 350 см до рН 7,5, а промыЕочные маточные растворы экстрагируют двумя поппиями хлороформа по 100 см. Концентрат п; омыг;ают, а хлороформовые экстррллы соединяют и концентрируют под поннкенпым давлепкем до получения объема 70 см. Затем добавляют 700 см гексана, и полученный осадок фильтруют, промывают и высушивают под пониженным давлением при температуре 30°С. Получают 5,1 г фракции FI, в основном содержапгей нервый активный компонент.

Сл1есь Д постепенно экстрагируют добавлением 3 л, а затем 1,5 л хлористого метилена. Экстракты хлористого метилена и смесь С соединяют и концентрируют под пониженным давлением до 800 см. Концентрат про - ывают 400 см воды, а затем снова концентрируют до получения объема 700 см. После этого добавляют 1 л гексана, и полученный осадок фильтруют, промывают и высушивают под пониженным давлением ппи температуре 30°С. Получают 3,7 г фракции F, в основном содержащей второй активный компонент.

Пример 6 10 г продукта, подобного фракции FI, после растворения в 200 см системы этилацетат - метанол - 0,067 мол/М/15 (буферный раствор фосфата с рН 5,5 (в соотношении 8:3:5, по объему) подвергают противоточнол1у распределению в 110 переносов в аппарат Крейга с 50 ячейками (50 переносов в аппарате с 60 переходов согласно методу единичного извлечения «single withdrawal), причем операцию начинают в первых двух ячейках. Собирают смесь высших фаз из ячеек с О по 37 (3,8 л) и концентрируют ее до получения 300 см. Этот концентрат и смесь низших фаз ячеек с О по 37 (3,8 л) соединяют и концентрируют до 800 см Величину рН доводят до 8 добавлением 180 см 1 н. едкого натра. Полученный раствор постепенно экстрагируют добавлением 800, а затем 400 см хлороформа. Хлороформовые экстракты концентрируют до 400 см и ппомывают 400 см подпхелоченной воды с рН 8; промывочные маточные растворы экстрагируют 200 см хлороформа. Промытый концентрат и хлороформовые экстракты соединяют, концентрируют

до 400 см, промывают 400 см подщелоченной воды с рН 8, концентрируют до 100 см, к ним добавляют 200 см бутанола и снова концентрируют до 100 см. Величину рН полученного бутанолового раствора доводят до 3,5 добавлением 30 см бутанола, насыщенного 1н. соляной кислотой, и раствор выдерживают в течение 12 час при 4°С. Образуются кристаллы, которые фильтруют, промывают и высушивают. Получают первые 4,55 г хлоргидрата сырого продукта первого активного компонента. Путем конгентрации кристаллизационных маточных растворов до 100 см, добавления 1 л гексака, а затем фильтран,ии, промывки и просушивания осадка получают вторую порцию 2,5 г хлоргидрата сырого продукта первого активного компонента.

Пример 7 3,75 г хлоргидрата сырого продукта первого aicTHBHoro компонента, полученного способом, описанным в примере 6, растворяют в 40 см диоксана, содержащего 20% воды. Полученный раствор фильтруют, а затем к нему добавляют сначала в течение двух часов 15 см безводного диоксана, а затем в течение 30 мин 235 см безводного диоксана. Получают продукт в виде кристаллов, который центрифугируют, промывают и просушивают. Получают 2,75 г хлоргидрата продукта первого активного компонента - красно-оранжевых кписталлов в виде игл, которые плавятся, оаспадаясь при 225-230°С. Титр 151 ед/мг.

0,203 г этого соединении рас воряют в смесн, сос- оянхей из 200 см воды и 150 см бутанола. Затем добавляют 3.4 см 0,1 н. . едкого натра, декантируют н экстрагируют водную Фазу с помощью 50 см бутанола. Бутаноловые экстракты соединяют, промывают двумя порциями по 100 см подщелоченной воды с рН 8 и концентрируют до объема 10 см. Полученный концентрат обрабатывают 50 см гексана. Осапок (Ъильтруют, промывают и высушивают. Получают 0,0945 г антибиотика первого активного компонента в виде красного аморфного порощка с титром 160 ед/мг.

Пример 8. 5 г продукта, подобного фракнии FS, полученной по способу примера 5, после растворения в 200 см системы этилацетат-метанол- 0,067 мол (М 15) буферный раствор фосфата с рН 5,5 (в соотношении 8 : :3:5, по объему) подвергают нротивоточному распределению, аналогично описанному в примере 6. Собирают -смесь высших фаз из ячеек с 36 до 89 (5,3 л) и концентрируют ее до получения 800 см. Концентрат постепенно экстрагируют двумя порциями хлористого метилена по 800 см, а затем 800 см хлороформа. Полученные экстракты собирают, концентрируют до 400 см, промывают двумя порциями по 400 см воды с рН 7,5 и, наконец, концентрируют до 10 см. Добавлением 100 см гексана образуется продукт осаждения, который фильтруют, промывают и высушивают под пониженным давлением. Получают 1,1 г антибиотика второго активного компонента в

виде красно-оранжевого аморфп,о порошка с титром 2650 ед/мг.

Пример 9 500 л сусла культуры, полученного как указано в примере 2, обрабатывают способом, описанным в примере 3. Получают 8,5 г сырого продукта с титром 395 ед/мг.

17 г сырого продукта, подобно этому, подвергают очистке способом, описанным в примере 4, но хлористый метилен заменяют этилацетатом. Получают 3 г антибиотика с титром 1300 ед/мг.

Пример 10 12,4 г продукта, полученного способом, описанным в примере 9, подвергают противоточному распределению в 50 переходов в системе бутаиол- М/3 буферный раствор фосфата с рН 7,35.

Путем экстрагирования бутанолом низших фаз ячеек с 12 по 35, концентрации бутаноловых экстрактов, промывки и добавления гексана получают первую порцию 1 г хлоргидрата продукта первого активного компонента, а после концентрации маточных растворов - вторую порцию 1,1 г хлоргидрата продукта первого активного компонента. После рекристаллизации в водном диоксане две эти порции представляют собой красно-оранжевые иголки, плавящиеся, распадаясь при 225- 230°С. Титр 67 ед/мг.

В результате обработки ячеек с 36 по 49 получают 1,1 г сырого продукта второго активного компонента с титром 1800 ед/мг. После противоточного распределения в 50 переходов в системе бутанол - этилацетат - буферный раствор Мак Ильвэна с рН 4 (в соотношении 3:7:10, по объему) получают 0,5 г продукта второго активного компонента в виде краснооранжевого аморфного порошка с титром 2000 ед/мг.

Пример 11 625 л сусла, «приготовленного способом, описанным в примере 2, помещают в чан с мешалкой. Величину рН доводят до 9 добавлением концентрированного раствора едкого натра. Взбалтывают в течение 30 мин, затем добавляют 32 г вспомогательного материала для фильтрации.

Смесь фильтруют на фильтр-прессе и промывают 275 л воды. В фильтрат, объем которого составляет 780 л, добавляют 156 кг хлористого натрия, а затем с помощью 12 н. соляной кислоты величину рН доводят до 3. Потом фильтрат экстрагируют 260 л бутанола. Бутаноловый экстракт концентрируют под пониженным давлением при температуре 35°G до -получения 4 л. Сырой антибиотик осаждают из раствора, осветленного 32 л петролейного эфира, центрифугируют, промывают и высушивают в сушильном шкафу при 30°С под вакуумом. Получают 227 т сырого продукта в виде коричнево-красного порошка с титром 45 ед/мг.

50 г предыдущего сырого продукта растворяют в 200 см бутанола, насыщенного водой, и полученный раствор хроматографируют при рН 4 через колонку, содержащую 500 см : окиси алюминия. После фиксации антибиотика начинают проявление и элюирование добавлением 4 л бутанола, насыщенного водой. Таким образом собирают 3 окрашенных фракции с соответствующими объемами 450, 1500 и 1500 см. Первую фракцию концентрируют под пониженным давлением до 50 см, а затем обрабатывают 500 см гексана; получают 8,3 г продукта с титром 68,5 ед/мг. Две последние фракции соответственно концентрируют под пониженным давлением до 100 см, затем обрабатывают I л гексана; получают соответственно 4,4 г продукта с титром 216 ед/мг и 1,35 г продукта с титром 800 ед/мг.

Пример 12 425 л сусла, приготовленного способом, описанным в примере 1 (титр 40 ед/см), (ПОДКИСЛЯЮТ до рН 1,8 щавелевой кислотой и фильтруют. Осадок после фильтрования промывают 100 л воды, подкисленной до рН 2 щавелевой кислоты; получают 0 500 л фильтрата. Этот фильтрат последовательно 2 раза экстрагируют до рН 8 добавлением 150, затем 100 л хлороформа. Экстракты соединяют и экстрагируют водой до рН 4; получают соответственно 80 и 50 л. Полученный 5 водный экстракт подщелачивают до рН 8 1н. раствором едкого натра и экстрагируют сначала 40, а затем 20 л хлороформа. Полученные таким образом хлороформовые экстракты подкисляют до рН 4 раствором уксусной кислоты 0 в хлороформе (10: 100, по объему). Подкисленный экстракт концентрируют при 30°С под пониженным давлением до 50 см. Затем сырой антибиотик осаждают 500 см гексана, центрифугируют, промывают и высущивают 5 в сушильном щкафу под вакуумом при 30°С. Получают 680 мг продукта в виде красного порошка с титром 1080 ед/мг.

Пример 13 500 мг антибиотика, -полученного способом, описанным в npnMeipe 4, растворяют в 100 см 1 н. серной кислоты и полученный раствор в течение 20 мин нагревают на водяной бане. После охлаждения экстрагируют тремя порциями этилацетата по 200 экстрагированный органический раствор затем просушивают на безводном сульфате натрия, фильтруют и концентрируют до небольщого объема. После фильтрования, промывки и сущки получают 218,5 мг кристаллов.

150 мг полученных кристаллов растворяют 50 в 3 см хлороформа и 1,5 см бензола. Раствор хроматографируют на бумаге (20 листов бумаги для хроматографии марки «Аршь № 310, проп-итанной ацетоновым раствором, содержащим 20% формамида). Затем прояв55 ляют в течение 90 мин с помощью смеси хлороформ-бензол (2:1), насыщенной формамидом. Основную зону ,86 вырезают на всех 20 листах бумаги, и полученные 20 зон измельчают в смесителе в при« 60 сутствии метанола. Смесь фильтруют, концентрируют и в нее добавляют 10 объемов воды. Полученный осадок фильтруют, .промывают и высушивают под пониженным давлением; получают 120 мг кристаллов, 170 мг 65 кристаллов, идентичных полученным, растворяют в 15 см диоксана с 20% воды. Затем по капле добавляют воду, подкисленную до рН 4 0,1 н. соляной кислотой. Образовавшиеся кристаллы фильтруют, промывают и высушивают; получают 130 мг агликона продукта в виде красно-оранжевых иголок, плавящихся при температуре }60°С, а затем при 225-230°С. Пример 14 500 мг антибиотика первого активного компонента, полученного способом, описанным в примере 7, обрабатывают серной кислотой, как это описано в примере 13, и получают 300 мг кристаллов, которые после очистки способом, описанным в том же примере 13, дают 202 мг агликона продукта первого активного компонента в виде красно-оранжевых иголок, плавящихся при 160°С, а затем при 225-230°С. Этот агликон идентичен агликону продукта 9865 R. Р. Предмет изобретения Способ получения антибиотика, отличающийся тем, что культуру Streptomyces соегиleorubidus 8899 или 31723 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и микроэлементы, в течение 2-5 дней при температуре и начальном рП среды 6,0-7,8 с последующим выделением, очнсткой и разделением целевого продукта известными приемами.

1500 то то I200 two woo 950 SOO SSO вОО S6789to 1 750 700 650 1500 fiQO 1500 1200 fWO WOO 950 900 850 800

BO 70 60 50 4C 30 29 W

Л

н/

7 5678Q10II Фиг.5

7 750 700 650 12./J« 15