Способ получения мутантов чумного микроба,дефектных по синтезу оболоченного антигена "фракции 1 Советский патент 1988 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к бактериальной генетике, а именно к области мутагенеза плазмид.

Целью изобретения является упроще- ние и повышение эффективности способа

Упрощение и повьшение эффективности способа достигается за счет высева клеток y.pestis 377 рУТ, рУУ, рУР :: Тп) на пластинку питательного агара, бедного по содержанию свободными двухвалентными катионами, с последующим исследованием выросших при 37°С клонов.

Способ осуществляется следующим образом.

Готовят 1 млрд взвесь 18-часовой культуры y.pestis 377 рУТ, рЗТ, рУР :: Тп) в физрастворе и 10 клеток высевают на пластинку 1,5%-ного агара В (или Хоттингера) с 15-25 мМ оксалата Na, рН 7,0-7,2. Посевы инкубируют 2-3 сут при 37°С.

В этих условиях на поверхности агара вырастают 200-400 коло- НИИ ( 3 мм в диаметре) на фоне газона мелких ( 1 мм) клонов. Клетки из крупных колоний после 2-кратной чистки на агаре с оксалатом Na при 37 С проверяют на способность к продукции фракции 1 в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с коммерческим антительным диагностику- мом и вьщеляют из них плазмидную ДНК. Достаточно исследовать 6-8 клонов, поскольку 90-95% крупных колоний не продуцируют фракцию 1 в результате делеции ДНК рУТ-плазмиды размером 15-20 Md. Продукцию токсина проверяют в реакции преципитации с анти токсической сьгеороткой. Она, как правило, сохраняется. Полученные деле- ционные варианты плазмид могут быть переданы в клетки авирулентных вак- ционных штаммов для конструирования безопасных штаммов-продуцентов с помощью известных способов при мобилизации конъюгативными Р-плазмидами. Пример 1. 10 клеток y.pestis 377 (рУТ, рУР::Тп1)высевают на поверхность агара LB, содержащего 15 М оксалата Na, рН 7,0 и инкубируют посевы при 37 С. Через 2 сут вырастают 200-400 колоний размером 3 мм. Бактерии из шести проверенных колоний не продуцируют фракцию 1 п данным РНГА, продукция мьшиного токсина по данным преципитации в теле с антитоксической сьшороткой у них со

5

0

5 Q д д

5

50

55

храпяется. Выделения и гель-электрофорез у плазмидной ДНК обнаруживают делецию плазмид рУТ. Реверсии к Fra -фенотипу не наблюдают в течение года при хранении штаммов при +4°С.

Пример 2. Ю клеток y.pestis 377 (рУТ, рУР::Тп10) высевают на пластинку 1,5%-ного агара 1 В с 20 мМ оксалата Ка, рН 7,2. Посевы инкубируют при З7 с 3 сут. Частота появления крупных колоний -10 . 10 таких клонов исследуют на продукцию фракции I, мьшиного токсина и проводят гель-электрофорез выделенной из них плазмидной ДНК. В восьми из них имеется делеция рУТ-плазмиды с потерей фракции 1, но с сохраненной продукцией мьшиного токсина.

Пример 3. 10 клеток штамма y.pestis 377 (рУТ::Тп, рУУ, рУР::Тп10) высевают на агар, содержащий 25 мм оксалата Na, рН 7,1, при 37 С. Через 2 сут отбирают для анализа 10 крупных колоний (частота их появления -10 ). В девяти из них отсутствует Fra 1 и имеет место делеция рУТ::Тп7 при сохранении признака.

Оптимальной концентрацией оксалата Na, добавляемого в питательный агар, является 20 мМ. Однако использование 15-25 мМ оксалата Na также дает хоро-- шие результаты. Концентрация вьшге 25 мМ ингибирует рост клеток, а при . дозе ниже 15 мН - Fra Р-клоны мало отличаются по размером от Fra 1 -вариантов, что затрудняет отбор мутантов. рН 7,0-7,2 используемой среды является обычной для выращивания клеток чумного микроба. Время инкубации, посевов 2-3 сут. Ранее 2 сут - колонии слишком мелкие, более -2 сут инкубировать не рекомендуется, так как Fra 1 -клоны увеличиваются в размерах, приближаясь по величине к Fra l -вариантам, что может затруднить отбор мутантов.

Предлагаемый способ позволяет получить Тох Fra -варианты штамма У. pestis 377, отсутствие оболочечного антигена у которых обусловлено потерей генов, детерминирующих его продукцию в результате делеции плазми- ды рУТ. Причина, обуславливающая такие делеции при росте используемого штамма на оксалатном агаре, пока не выявлена. Возможно это результат

314

индукции IS-рекомбинации в условиях дефицита Са и Mg . Полученный де- леционньй вариант плазмиды рУТ из У. pestis 377 легко передать путем тран дукции или мобилизации конъюгативной R-плазмидой в другие штаммы чумного микроба. При этом в силу несовместимости гомологичных репликонов происходит утрата резидентной рУТ-плаз- МИДЫ и полученные штаммы приобретают .стойкий -фенотип.

Предлагаемый способ является простым, поскольку для получения искомых мутантов достаточно однократного посева клеток У.pestis 377 на агар с оксапатом Na, в то время как из- вестньш способ требует мнoгoкpaт ыx пересевов на средах с дефицитной сывороткой к фракции 1. Значительно повьш1ается эффективность способа. Если в известных способах удается получать единичные мутанты, не продуцирующие оболочечный антиген, которые к тому же часто реверсируют к

2

дикому фенотипу, предлагаемый спосбб обеспечивает выход сотен клонов со стабильным Fra I -фенотипом: .- вследствие делеции соответствующих генов. Кроме того, способ не требует использования дорогих реактивов и занимает мало времени.

Формула изобретения

Способ получения мутантов чумного микроба, дефектных по синтезу оболо- чечного антигена фракции I путем посева взвеси на питательную среду, инкубирования при 37°С и исследования выросших клонов, о т л и ч а ю- щ и и с я тем, что, с целью упрощения и повьш1ения выхода мутантов, взвесь клеток штамма Yersinia pestis 377, содержащего наряду с плазмвдами рУТ, рУУ плазмиду рУР::Тп, детерминирующую пестиционогенность, высеват на оксалатный агар, содержащий 15-25 мМ оксалата натрия, и инкубируют 2-3 сут.

Изобретение относится к области бактериальной генетики, а именно к области мутагенеза плазмцц (П). До настоящего времени не существует простого и надежного способа получения Fra Г тох штаммов- (Ш) чумного микроба, необходимых для конструирования, высокоактивных Ш-продуцентов мы- шиного токсрна. Целью изобретения является упрощение и повышение эффективности способа получения мутантов чумного микроба, у которых стабильно отсутствует способность к продукции фракции 1 при сохранении Тох -признака. Цель достигается за счет отбора клонов с делецией генов, определяющих продукцию Fra 1 на рУТ-плазмиде Ш y.pestis 377, после посева клеток этого Ш, содержащего П рУР: : Tii, на оксалатный агар при 37 С. Способ применяется в генетических исследованиях с У. pestis для исследования роли Fra 1 в биологии этого микроорганизма и упрощают получение моноспецифических диагностических сывороток к мьшиному токсину чумного микроба. (Л