Рекомбинантная плазмидная ДНК pJ G824, кодирующая J-антиген чумного микроба, способ ее конструирования и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент J-антигена чумного микроба Советский патент 1992 года по МПК C12N15/31 

Изобретение относится к генетической инженерии и касается способа получения I антигена чумного микроба в клетках бактерий Escherichia coli.

I антиген синтезируется в клетках чумного микроба при росте на 37° С в богатой среде при рН 5,8-6,0 (1).

Из а.с. 1103555 известен штамм Yersinia pestls - продуцент I антигена (2). Продуктивность этого штамма авторы выражают в гемагглютинирующих единицах, под которыми понимают максимальное разведение образца, еще дающее положительный результат, но не приводят данных о количественном выходе продукта. Необходимо отметить, что процесс культивирования клеток штамма - продуцента занимает длительное время (от 3 до 8 суток) и требует использования обогащенных питательных сред. Кроме того, при использовании клеток Yersinia pestis для выделения 3 антигена существует сложность в отделении D антигена от FI антигена (из-за близости мол. масс).

Цепью изобретения являлся повышение выхода I антигена, ускорение и упрощение способа его выделения.

Для этого создана рекомбинантная плазмидная ДНК plG824, кодирующая синтез I антигена и состоящая из следующих элементов: 1) космидная ДНК рНС79 размером б т.п.о.; 2) фрагмент Kpnl-RcoRI размером 6,5 т.п.о., содержащий ген(ы) антигена под собственным промотором; 3) фрагмент Kpnl-Hindlll размером 0,5 т,п.о. - часть малой плазмиды pPst I чумного микроба.

Для достижения цели используют способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК plG824, заключающийся в том, что фрагменты хромосомной ДНК чумного микроба после неполного гидролиза рестриктазой EcoRI лигируют с ДНК косми- ды рНС79, гидролизованной рестриктззой EcoRI. упаковывают в фаг, заражают им клетки Escherichia coif, которые выращивают на агаризованной среде с ампициллином, из выросших клонов, дающих

-Ч О 00 О

СО

ю

положительную реакцию иммунопреципи- тации с анти-l моновалеитной сывороткой, выделяют ДНК, полученную ДНК и ДНК плазмиды pPstl вначале гидролизуют ре- стриктазой Kpnl, затем лигируют, лигайной смесью трансформируют клетки Escherichla coll, из клонов, синтезирующих I антиген, выделяют ДНК, гидролизуют ее последовательно ресткриктазой Hindlll и рестрикта- зой Claf, лигируют и отбирают рекомбинатную плазмидную ДНК размером 13 т.п.о.

Штамм - продуцент антигена получен трансформацией клеток E.coli HB101 ре- комбинантной плазмидной ДНК plG824.

Штамм Escherichia coll HB101 (plG824) характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясопептон- ном питательном агаре Дифко колонии гладкие круглые, плоские, серые, блестящие, мутные, края ровные. При росте на жидких средах: мясопептонном или LB бульоне образуют ровную интенсивную муть,

Физиолого-биохимические признаки,

Клетки растут при температуре 4-45° С при рН 5,8-8,0.

Синтез 1 антигена и его секреция в куль- туральную жидкость происходит при выращивании культуры E.coli в забуференной среде (рН 5,8-6,0) при 37°С

В качестве источника углерода клетки используют многие углеводы, спирты, органические кислоты; в частности1 d- глюкозу, d - фруктозу, треуголозу Не усваивают ацетат, аданит, лактозу, ксилозу Источником азота служат как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и пептон, аминокислоты в органической форме. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают Индол не образуют. Уреазную активность не обнаруживают.

Устойчивость к антибиотикам

Проявляют устойчивость к ампициллину, обусловленную рекомбинантной плазмидной ДНК plG824, а также к стрептомицину, обусловленную мутацией в хромосомном гене rpsL у штамма E.coti НВ101.

Пример 1. Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК plG824.

Клетки вакцинного штамма EV76 Y. pestis выращивают в 100 мл LB бульона с добавлением 1% гемолизированной крови в течение 48 час при 28° С. Клетки осаждают центрифугированием (SOOOg. 4 с, 5 мин), ре- суспендируют в 10 мл раствора А (трис-HCI, рН 8,0 - 25 мМ, ЭДТА - 10 мМ глюкоза - 50

мМ) и выдерживают во льду 10 мин. Затем добавляют равный объем 2 % раствора ДСН. перемешивают и помещают в водяную баню на 65° С на 30 мин. После этого добавляют

проназу (50мкг/мл)и инкубируют 16час при 37° С. Депротеинизацию проводят 3-кратной обработкой фенолом, насыщенным ТЕ (трис-HCI, рН 8,0 - 10 мМ, ЭДТА - 1 мМ) объем:объем. К водной фазе, отобранной

0 после третьей экстракции, добавляют 3 объема 96% этилового спирта. Выпавшую в осадок высокомолекулярную ДНК наматывают на стеклянную палочку. После 5-кратной промывки 70% этиловым спиртом

5 осадок растворяют в ТЕ буфере. Качество и количество хромосомной ДНК проверяют с помощью электрофореза и в пробных реакциях рестрикция-лигирование,

Космидную ДНК рНС79 выделяют со0 гласно (3). Концентрацию плазмидной и хро- мосомнойДНКопределяют

спектрофотометрически (при 260 нм с использованием коэффициента экстинкции 0,02 см/мкг). Полученные препараты хромо5 сомной и плазмидной ДНК используют для конструирования плазмиды plG7. Это конструирование проводят следукщим образом: 2 мкг хромосомной ДНК инкубируют с рестриктазой EcoRI (5 ед.) в буфере 3 (трис0 HCI, рН 8,0 - 50 мМ, MgCi - 10 мМ, Nad - 100 мМ). Реакцию проводят при 37° С в течение 1 час, отбирая аликвоты каждые 15 мин. После расщепления пробы анализируют с помощью электрофореза в 0,2 % агароз5 ном геле, 2 мкг космидной ДНК рНС79 инкубируют с рестриктазой EcoRI (5 ед,) в буфере 3 при 37° С в течение 1 час. Полноту рестрикции проверяют с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле. Для лигиро0 вания используют фрагменты ДНК хромосомы размером 35-40 т.п.о. Перед ли- гированием рестрицированные фрагменты ДНК прогревают при 65° С 10 мин.

Соединение фрагментов хромосомной и плазмидной ДНК проводят в рестрикцион5 ном буфере с добавлением: АТФ до концентрации 1мМ, ДТТ - до 5 мМ и ДНК-лигазы фага Т4 (3-4 ед. Вейса). При лигировании смешивают 2 мкг хромосомной ДНК с 1,5 мкг плазмидной ДНК. Реакцию проводят в

0 течение 16 час при 14° С. Качество лигиро- вания проверяют электрофорезом в 0,4% агарозном геле. Полученную смесь реком- бинантных космид упаковывают в головку фага (3). Фаголизатом заражают клетки

5 E.coli i HB101, выращенные в LB бульоне с добавлением мальтозы (0,2%) и MgSO (10 мМ). Адсорбцию фага проводят в течение 20 мин при 37° С После подращивания в LB бульоне в течение 2 час при 37° С клетки

высевают на селективную среду, содержащую ампициллин в концентрации 100 мкг/мл,

Из сконструированного таким образом банка генов Y.pestis отбирают клон, дающий положительную реакцию диффузионной преципитации с моновалентной анти-1 сывороткой (4). Рекомбинантная плазмид- ная ДНК, выделенная из этого клона, получает наименование рЮ7(фиг. 1).

Рекомбинантную плазмидную ДНК pIG7 используют в качестве донора при создании плазмиды plG82. В качестве вектора при этом используют предварительно созданную плазмиду рР - делеционный вариант малой плазмиды pPstl Y.pestis, в которой фрагмент EcoRI - Hindlll заменен на фрагмент ДНК, кодирующий ген cat (устойчивости к хлорамфениколу)из плазмиды pBR325. 1 мкг ДНК плазмиды plG7 смешивают с 1 мкг ДНК плазмиды рР1 и инкубируют с рестриктазой Kpnl (5 ед.) в буфере 1 (трис-HCI. рН 8,0-50 мМ, MgCI - 10 мМ) при 37° С в течение 1 час. Полноту рестрикции контролируют с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле. После инкубации смесь прогревают при 65° С 10 мин. Соединение фрагментов проводят в рестрикцион- ном буфере с помощью ДНК-лигазы фага Т4 по описанной методике. Полученной смесью плазмид трансформируют клетки E.coli HB101 с применением СаС - методики (3). Отбор трансформантов проводят на среде, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и хлорамфеникол (20 мкг/мл) Из выросших клонов отбирают те. что способны давать положительную реакцию имму- нопреципитации с моновалентной анти-1 сывороткой (4). Плазмида из этих клонов мол. массы 19 Md размером около 29 т.п.о. получает наименование рЮ82 (фиг. 1). Из этой плазмы получают плазмиду рЮ822 де- летированием Hindlll фрагмента размером около 12 т.п.о. Для этого 1 мкг ДНК плазмиды plG82 рестрицируют нуклеазой HindUl (5 ед.) в буфере 3 при 37° С в течение 1 ч. Полноту реакции проверяют в электрофорезе, Лигирование проводят в рестрикцион- ном буфере по описанной методике. Смесью плазмид трансформируют клетки E.coli HB101 (3) Среди выросших на селективной среде (ампициллин - 100 мкг/мл) клонов отбирают те. которые дают положительную реакцию диффузионной преципитации с моновалентной анти-l сывороткой и неспособны расти на среде с хлорамфени- колом. Удаление фрагмента ДНК проверяют с помощью гидролиза HindUl нуклеазой и последующим электрофорезом Сконструированная рекомбинантная плазмидная

ДНКполучает наименование plG822, ее размер составляет величину 17 т.п.о. (фиг. 1), Из плазмиды plG822 создают плазмиду plG824 делетированием фрагмента Clal размером около 4 т,п.о. 1 мкг ДНК плазмиды

рестрицируют Clal экдонулеазой (5 ед) в буфере 1 при 37°С в течение 1 ч. Полноту рестрикции проверяют с помощью электрофореза. Лигирование проводят с помощью лигазы фага 14 по описанной методике.

Смесью плазмид трансформируют в клетки E.coli HB101 (3). Среди выросших на среде с ампициллином (100 мкг/мл) клонов отбирают те, что дают положительную реакцию иммунопреципитации с моновалентной анти-1-сывороткой. Выделенную их этих клонов ДНК подвергают гидролизу эндонуклеазой Clal и электрофорезу для проверки удаления Clal фрагмента. Плазмида молекулярной массы 8,5 Md размером 13

т.п.о., кодирующая синтез I антигена в клетках E.coli получает наименование plG824 (фиг. 1).

Штамм-продуцент I антигена получают, трансформируя клетки штамма Escherichia

coli HB101 рекомбинантной плазмидной ДНКр1С824.

Пример 2. Способ выделения I антигена из клеток рекомбинантного штамма E.coli HB10t().

Для выделения I антигена используют

биомассу клеток рекомбинантного штамма E.coli HB101(plG824). вырашечную в матри: цах на мясопептонном агаре при рН 5,8-6,0, температуре 37 °С в течение 16-18 час. Микровную массу смывают Na-фосфатным буфером рН 7,0-5 мМ с помощью стеклянных бус. Биомассу осаждают центрифугированием (12000д, 10 мин, 4°С). К супернатанту добавляют сульфат аммония до 40% насыщения. Через 2 час раствор повторно центрифугируют. Осадок, представляющий собой практически чистый I антиген, перерастворяют в том же фосфатном буфере и хранят при температуре -20°С. Содержание

белка в препаратах определяют спектрофо- тометрическим способом (5). Гомогенность препарата тестируют электрофорезом по Laemmli (6) и в реакции диффузионной преципитации (4)

Полученный антигенный препарат из

клеток кишечной палочки с поливалентной противочумной сывороткой формирует одну дугу преципитации в иммуноэлектрофоре- зе, В реакции диффузионной преципитации

с антисывороткой полоса преципитации этого антигена (фиг. 2 поз. 4, 6) сливается с полосой преципитации I антигена чумного микроба (фиг. 2 поз 3: поз. 1, 2, 5 - отрицательный контроль; поз. 7 - анти (I+FI) сыворотка).

При иммунизации кроликов I антигеном, выделенным из клеток рекомбинантно- го штамма E.coli HB101(plG824), получены специфические моновалентные сыворотки. Эти сыворотки образуют одну замыкающуюся полосу преципитации с антигеном как из клеток рекомбинантного штамма, так и из клеток вакцинного штамма EV76 Y.pestis.

В ДСН-электрофорезе t антиген сегрегирует на субъединицы мол. массой около 14 Kd (фиг. 3 поз. 1 - маркеры мол. масс; поз. 2 - рекомбинантный I антиген; поз. 3 - I антиген из клеток штамма EV76.

В настоящее время в литературе нет данных о клонировании хромосомной области Y.pestis. кодирующей 1 антиген. Все плазмиды, полученные в работе, являются оригинальными.

Использование рекомбинантного штамма Е.соН НВ101(р1С824)для получения I антигена позволяет преодолевать ряд существенных недостатков, присущих извест- ным методам. Во-первых, созданная генно-инженерная конструкция обеспечивает:

-10-кратное повышение выхода продукта (от 2-4 мкг/мл до 40 мкг/мл);

-отсутствие сопутствующего трудно отделимого компонента (FI антигена чумного микроба).

Вследствие этого появляется возможность одношзговой очистки продукта без использования хроматографического оборудования.

Во-вторых, использование в качестве продуцента клеток бактерий Е.соЛ вместо V. pestis позволяет:

-использовать при культивировании более дешевые среды (без добавления гемо- лизированной крови);

-сократить время культивирования в 4-12 раз (3-8 сут до 16-18 ч).

Все выше перечисленные преимущества позволяют ускорить, упростить и удешевить способ получения I антигена чумного микроба. Формула изобретения

1.Рекомбинантная плазмидная ДНК pi G824, кодирующая 1-знтиген чумного мйкроба, размером 13,0 т.п.о., содержащая: v

-Eco Rl - Hind III - фрагмент ДНК кос- миды рНС79 размером 6,0 т.п.о.;

-Hind III - Kpnl - фрагмент ДНК пести- циногенной плазмиды pPstl Versinfa pestis размером 0,5 т.п.о,;

-Kpn I - Eco RI - фрагмент ДНК, коди- рующий синтез l-антигена Yerslnia pestis,

размером 6,5 т.п.о.;

-уникальные сайты рестрикции: по два Clal, Hind III, SalGt сайта, один Kpn I сайт;

-генетические маркеры;

- ген устойчивости к канамицину.

2.Способ конструирования рекомби- каитнойплазмиднойДНКр G824, заключа- ; ющийся в том, что фрагменты ДНК чумного микроба после неполного гидролиза рестриктазой EcoRI лигируют с ДНК космиды рНС79. гидролизованной рестриктазой EcoRI, упаковывают в фаг Я, заражают им клетки Escherichia coll, которые выращивают на агаризованной среде с ампициллином, из выросших клонов, дающих положительную реакцию иммунопреципи- тации с анти-l моновалентной сывороткой, выделяют ДНК, полученную ДНК и ДНК плззмиды pPstl, гидролизуют рестриктазой

Крп1, а затем лигируют, лигазной смесью трансформируют клетки Escherichia coli, из клонов, синтезирующих I антиген, выделяют ДНК, гидролизуют ее последовательно рестриктазой Hind III и рестриктазой С1а1,

лигируют и отбирают рекомбинантную плазмидную ДНК plG824 размером 13,0 т.п.о,

3.Штамм бактерий Escherichia coif ВКПМ В-5348-продуцент i-антигена.

г

-6:

s: з

го

JO

%

o u o

01

I

Ј 3

i

92.5 (К

Использование: получение 1-антигена чумного микроба. Сущность изобретения; получены рекомбинантнаяплазмидная ДНК plG824 и штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-5348-продуцент 1-антигенэ, кодирующая 1-антиген чумного микроба, разработан способ конструирования плазмиды . 3 ил.

чНШшм

3L

-

0uz3