Способ трансдукции хромосомных маркеров и плазмид у YeRSINIa реSтIS Советский патент 1990 года по МПК C12N15/00 

титром 10 БОЕ/МЛ смешивают по О, 1 мл 18-часовой бульонной культурой , pestis EV76, которая не нуждается в аргинине, выращенной при 28 с до концентрации 10 м.кл/мл. Смесь инкубируют при 37 25-30 мин и высевают в 3 мл 0,6%-ного агара,LB, которые затем выливают на поверхность 1,5%- ного агара LB. Чашку инкубируют сут- JQ ки при 37 С, По окончании инкубации верхний слой агара 0,6%-ного) собирают в центрифужную пробирку, добавляют 0,2 мл хлороформа, встряхивают в течение 3 мин, дают постоять при ком- i натной температуре 30 мин. Затем низ- коскоростным центрифугированием (бООО об/минJ 15 мин) осаждают агар и остатки клеток. Надосадочную жидкость проверяют на стерильность вы- 20 севом на питательный агар и в питательный бульон LB, после чего используют как трансдуцирующий лизат. Титр полученного таким образом фага при проверке на газоне культуры Y, pes- 25 tis EV76 обычно достигает 10 БОЁ/шт,

Для проведения трансдукции смешивают по 0,5 мл 18-часовой бульонной культуры arg--зaвиcимoгo реципиента Y. pestis EV76 (экспоненциальная фаза JQ роста), выращенной при 28 С, и транс- дуцирующего лизата (10 БОБ/мл). Смесь инкубируют при 25-30 мин. Осаждают клетки центрифугированием (6000 o6/MHHj 15 мин) промьшают физи- 5 ологическим раствором и высевают на плотную агаровую среду М9, содержащую добавки, необходимые для роста независимого от аргинина Y,pestis EV76 . Контролем посев на эту же Q среду культуры реципиента, обработанной также, как опытная проба, но без добавления трансдуцирующего бактериофага. Посевы инкубируют при 28°С до появления трансдуктантов (обычно 5- 45 6 сут). Частота трансдукции хромосомных генов составляет 10 , На одной пластинке агара вырастает от 10 до 100 трансдуктантов.

Пример 2, Трансдукция плазми-,,. ды RP4.

Трансдуцирующий лизат готовят как описано в предьщущем примере, i используя в качестве донора культуру штамма Y,pestis EV76 (RP4/Tc Km ApRT, 55 на которой размножают трансдуцирую- щий фаг. Смешивают по 0,2 мл этого ) лизата (10 БОЕ/мл) и реципиентной 18-часовой бульонной культуры штамма

Y,pestis Otten str, выращенной при 28 С, После инкубации смеси при в течение 30 мин по 0,2 мл ее высевают на 1,5%-ный агар LB с тетрациклином (12,5 мкг/мл). Контролем служат посевы фаголизата на стерильность и бактерий реципиента на агаровую среду с тетрациклином. Выросшие колонии отсевают и после дополнительного рассева ; на изолированные колонии проверяют по Ар и Km маркерам плазмиды RP4, Частота трансдукции составляет .

ПримерЗ, Контрансдукция pro- и gua-геново

Трансдуцирующий лизат готовят как описано выше, размножая фаг на культуре донора Y, pestis Otten, прото- трофного по пролину и гуанину 0,5 мл полученного лизата (10 БОЕ/мл) смешивают с 0,5 мл 18-часовой бульонной культуры реципиента Y, pestis Otten pro gua str. После инкубации в течение 25-30 мин при 37°С клетки осаждают центрифугированием (6000 об/мин, 15 мин), промьгеают физиoлoгичecкIiм раствором и высевают на два варианта минимального агара К9, необходимыми для роста реципиентами, исключая в одном варианте этой среды пролин, в другом - гуанин. Посевы инкубируют при 28 с 5-6 сут. Сформировавшиеся на обеих селективных средах колонии рассевают повторно на той же среде и затем по 2 выросшие колонии каждого трансдуктанта отбирают для проверки их зависимости от пролина и гуанина. 80% колоний, выросших без пролина (частота их появления ) не нуждаются в гуанине, и наоборот, 80% гуаниннезависимых трансдуктантов могут расти на среде без пролина, то есть частота совместной передачи этих двух маркеров составляет 80%.

Использование во всех трех приемах Str реципиентов при отсутствии этого маркера у донорных бактерий позволяет провести дополнительньй контроль трансдукции: все трансдук- танты должны быть с этим маркером.

Для экспериментов по трансдукции у Y, pestis могут быть использованы как среды импортного производства на основе дрожжевого экстракта и пептона фирмы Difco (например, агар LB), так и отечественные качественных серий (типа агара Хоттигера). В качестве минимальной среды приме

5,13

няют агар М9, в общеизвестную основу среды MS добавляют до 1,5% агар-агара Difco или выеокоочищенного качественного отечественного агар-агара и для обеспечения роста бактерий Y,pes tis на 100 мл среды - 0,2 10%-ного раствора сёрно-кислого магния,0,5 мл 20%-ного раствора серно-кислого аммония, 0,5 г сульфита натрия, разведенного в 2 мл дистиллированной воды, и 0,4 мл 40%-ного раствора глюкозы, а также фенилал и метионин в количестве 0,1 мл О,1%-ного раствора, по которым бактерии штаммов EV76 и Otten яв- ляются природными ауксотрофами.

Трансдукцию с помощью бактериофага Р1 cml clr 100 ts pi можно эффективно проводить с любыми штаммами чумного микроба.

Время, затрачиваемое на проведение трансдукции, не превышает 24 ч, что в 3-5 раз быстрее, чем при использовании ранее применяемых фагов, Появляется возможность проведения одновременного множества опытов по

трансдукции, используя в одном экс- . перименте несколько доноров и реципиентов, а не 1-2, как это позволяет принятая в практике для Y.pestis методика. Наконец, на пластинках селективных сред вырастает на 1-2 порядка большее количество трансдук- тов, что способствует более эффективному сбору и анализу трансдуктантов при работах по контрансдукции, а Tak- же интенсификации работ по конструированию нужных для экспериментов штаммов.

Формула изобретения

Способ трансдукции хромосомных маркеров и плазмид у Yersinia pestis путем обработки клеток реципиентов фа- голизатом, отличающийся тем, что, с, . целью повьшения частоты трансдукции и упрощения способа, лизат получают из фагов Р1 cml clr 100 ts pi, выращенных в слое мягкого агара на культуре клеток Y.pestis.

Изобретение относится к бактериальной генетике, именно к спосоИзобретение относится к области бактериальной генетики, а именно к области переноса генов микроорганизмов с помощью трансдукции. Цель изобретения - повьппенйе частоты трансдукции и упрощение способа. Это достигается путем использования фага Р1 cml clr 100 ts pi, который является производным фага Р1 cml clr 100 ts, способного размножаться на культуре чумного микроба в слое мягкого агара с образованием негативных колоний, что обеспечивает возможность: получать без дополнительного концентрирования препараты этого бактериофага, достигающие титбам переноса генов микроорганизмов с помощью трансд тсции. Цель изобретения - повышение частоты трансдукции и упрощение способа. Для этого исполЬ- зуют фаг Р1 cml clr 100 ts pi, являющийся производным фага PI cml clr 100 ts, способного размножаться на культуре чумного микроба в слое мягкого агара на культуре клеток топ. Yersinia pestis с образованием негативных колоний при обработке клеток- реципиентов полученным лизатом. Это обеспечивает получение без дополнительного концентрирования препаратов этого бактериофага, с титро м . 10 БОЕ/МЛ исключение ультрацентрифугирования фага исключение предварительной лизогенизации клеток до- Hopaj осуществление эффективной трансдукции по упрощенной методике. (Л ра 10 БОЕ/мл{ исключить ультрацентрифугирование фага; исключить предварительную лизогенизацию клеток донора и осуществлять эффективную транс- дукцию по упрощенной методике. Способ осуществляется следующим образом. Получают фаголизат в результате рамножения фага Р1 cml clr 10.0 ts в слое мягкого агара на культуре клеток топ. Y. pestis, после чего обраба- тьшают клетки реципиенты этим лизатом. Пример 1. Траисдукция arg- гена Y. pestis. Для приготовления трансдуцирующего лизата фаг Р1 cml clr 100 ts pi с