Способ получения полиауксотрофных мутанов Советский патент 1986 года по МПК C12N15/00 

ел

1C

ю

Изобретение относится к бактериальной генетике, а именно к получению штаммов с множественной ауксотрофностью.

Известен способ получения полиауксотрофных штаммов Vibrio cholera с помощью перестроек, индуцированных транспозонами (Тп), предусматривающий введение Тп 10 или Тп 9 в геном исследуемого, микроорганизма и поиск среди клонов, получивших транспозон моноауксотрофных мутантов, в популяций которых с помощью прямого анализа или метода пенициллинового обогащения выявляют инду- цированные транспозоном дополнительные разнообразные мутации.

Однако этот способ позволяет получать случайный набор ауксотрофных мутаций, а не заранее определенный задачами предстоящего эксперимента. Дополнительные мутации возникают в результате инверсий, когда участки хромосомы оказываются перевернутыми на 180°, или делеций (утраты фрагментов ДНК различной длины), что существенно меняет порядок генов и ее структуру. Поэтому такие полиауксотрофные штаммы являются нетипичными и не могут быть использован в большинстве генетических экспериментов. Более того, ауксотрофы, появляюш 1еся в результате инверсий, нестабильны и с высокой частотой реверсируют к исходному типу. Данны способ является трудоемким особенно применительно к чумному микробу, поскольку требует проверки большого количества клонов, использования многократного пенициллинового обога щения и занимает много времени.

Цель изобретения - получение полиауксотрофов чумного микроба с заданными мутациями.

Это достигается тем, что согласно способу получения полиауксотрофных мутанов Yersiraa pestis путем транслокации транспозона и анализа популяции на присутствие мутаций трансдуцируют фагом PI cml clr 100 в реципиентную клетку стабильные мутации, каждую из которых индуцируют различными транспозонами с предварительной селекцией на полноценной питательной среде.

Пример 1, Культуру Y. pestis с встроенным в определенном локусе хромосомы тра;;спозоном, например, Y. pestis EV arg :: Тп 10 выращивают в бульоне LB до концентрации 1-10 клеток в 1 мл. После этого добавляют лизат фага Р1 cml clr lOD ts, индуцированного из штамма с известной нужной ауксотрофностью, опосредованной другим транспозоном, например gua :: Тп 5. Множественность инфекции должна быть равной 1. Через 1 ч инкубации при 28°С смесь культуры и фага высевают на 1,5% агар LB, рН 7,2, содержащий в данном случае 100 мкг/мл канамицина. Через 3 сут инкубации посевов при 28°С появляется рост в виде изолированных колоний. Бактерии из нескольких колоний проверяют на получение дополнительной ауксотрофностн, в приведенном примере по гуанину, с использованием синтетической среды.

Частота котрансдукции ауксотрофности с Тп 5, Тп 7, Тп 9, Тп 10 составляет 70-100%. Полученный предлагаемым способом диауксотроф Y. petis EV arg :: Тп 10 gua : Тп 5 подвергают аналогичной обработке лиза,том Р1 cml clr 100 ts, индуцированным из штамма с требуемой ауксотрофностью по триптофану, которая обусловлена Тп 7 (trp::Tn 7). Таким образом получают штамм, зависимый от трех нужных аминокислот Y. pestis EV arg :: Тп 10 gua :: Тп 5 trp :: Тп 7.

Пример 2.,Ночную бульонную культуру Y.pestis EV ilv :: Тп обрабатывают по описанной методике лизатом Р1 cml clr 100 ts,индуцированным из Y. pestis EV ser :: Tn с высевом смеси на агар LB с канамицином. После проверки выросших канамицинрезистентных клонов на ауксотрофность по серину, получившийся диауксотроф Y. pestis EV ilv :: Tn 3 ser :: Tn 5 обрабатывают фагом P1 cml clr 100 ts, индуцированным из Y. pestis EV ura: : Tn 10, с высевом смеси на агар LB с тетрациклином. 70-100% тетрациклинрезистентных клонов, выросших в этих условиях, будут иметь геноти Y. pestis EV ilv :: Tn 3 ser :: Tn ura :: Tn 10.

Пример 3. Если для последующих экспериментов по картировани хромосомы Y. pestis требуется штаммреципиент, ауксотрофный по пролину, аланину, тиамину, аденину, ночную бульонную культуру Y. pestis EV pro :: Tn 9 обрабатьшают Pi cral clr 100 ts индуцированным из У. pestis. EV ala :: Tn 1. После проверки вырос ших ампициллинрезистентных клонов на ауксотрофность по аланину, полученньш штамм обрабатывают лизатом фага Р1 cml clr 100 ts индуцированным из Y. pestis EV thi :: Tn 5 с iвысевом на агар с канамицином, а в отобранные штаммы Y. pestis EV pro :: Tn 9 ala :: Tn 1 thi ;: Tn 5 вводят ауксотрофность по аденину путем трансдукции этого маркера из

1715224

Y. pestis RV acle :: Tn 10.Таким образом получают штамм с заданными маркерами Y. pestis EV pro :: Tn 9 ala :: Tn 1 thi :: Tn 5 acle :: Tn 10.

5 Предлагаемый способ позволяет комбинировать в изучаемых штаммах Y. pestis различные заведомо заданные ауксотрофности, дает возможность использовать для селекции полноценfO ные питательные среды, что особенно упрощает работу с чумным микробом, отличающимся прихотливым ростом на синтетических средах. Полученные полиауксотрофы стабильны и для получения нескольких нужных новых вариантов требуется не больше месяца.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИАУКСОТРОФНЫХ МУТАНОВ Yersinia pestis путем транслокации транспозона и анализа популяции на присутствие мутаций, отличающий с я тем, что, с целью получения полиауксотрофов с заданными мутациями, трансдуцируют фагом Р1 cml clr 100 ts в реципиёнтную клетку стабильные мутации,каждую из которых индуцируют различными транспрзонами с предварительной селокцией на полноценной питательной среде.