Способ получения мутантов чумного микроба дефектных по синтезу капсульного антигена фракции I Советский патент 1992 года по МПК C12N15/01 

Изобретение относится к бактериальной генетике, а именно к области направленного делеционного мутагенеза плазмид

Известен способ получения мутантов чумного микроба, дефектных по синтезу капсульного антигена фракции I, путем посева взвеси на питательную среду, содержащую 15-25 мМ оксалата натрия, и инкубирования при 37°С, что приводит к получению в популяции Tox+Fra мутантов Y. pestis. Отсутствие капсульного антигена у них обусловлено потерей генов, детерминирующих образование капсулы в результате делеции фрагмента плазмиды pFra/Tox.

К недостаткам прототипа следует отнести то, что причина, обусловливающая такие делеции, не выявлена Делеция составляет 25-33% от размера плаэмидного реплико- на. Это приводит к значительному нарушению структуры всей плазмиды pFra/Tox. Выращивание культур Y pestis на кальций- дефицитных средах при 37°С вызывает повреждения не только плазмиды pFra/Tox, но и инсерции, делеции плазмиды pCad различной протяженности и мутации в хромосоме Y. pestis. Это в свою очередь приводит

к изменению биологических свойств микроба.

Цель изобретения - повышение выхода мутантов со строго определенными делециями

Цель достигается за счет осуществления целенаправленной мутации, приводящей к делеции структурной части fra-оперона. Это происходит в результате гомологичной рекомбинации в клетках Y. pestis гибридной конструкции pFK23 с интактной плазмидой. Затем отбирают бескапсульные варианты по КтгАр8-феиотипу.

Сущность изобретения заключается в конструировании гибридной плазмиды на основе вектора рНС79. Данный вектор содержит геи /J -лактамазы и не способен стабильно наследоваться в клетках чумного микроба без селективного давления Гибридная плазмида несет в своем составе фрагмент ДНК плазмиды pFra/Tox, где центральная область этого фрагмента, несущая структурную часть fra-оперона, замещена на ген устойчивости к канамицину. Наличие в рекомбинантной плазмиде областей гомологии с плазмидой pFra/Tox, фланкируюсл

с

XI ел VJ XI о

щих ген антибиотикоустойчивости, при трансформации клеток Y. pestis гибридной плазмидой обеспечивает гомологичную рекомбинацию с плазмидой pFra/Гох, в результате чего у части микробной популяции на интактной плазмиде pFra/Tcx происходит замещение структурной части fra-one- рона на ген устойчивости к канзмицину, а структурная часть fra-оперона люминирует из микробной клетки. Инкубируют трансформанты при 28°С в течение 2-3 сут на питательном агаре, содержащем 5 мкг/мл канаиицина. Выросшие клоны пересевают на агар со 100 v.sr/мя ампициллина и отбирают клоны с фенотипом KmrAps.

Клоны с KmrAps фенотипом составляют 0,1-15% от числа всех грансформантов, причем 100% клонов с КтгАр8-фенотипом несут делецию структурной части fra-onepo- па. Содержание в популяции рекомбинант- ных клонов с КгпгАрч-фенотипом можно увеличить до 50-80% путем заражения смесью трансформантов белых мышей, предварительно иммунизированных фракцией 1. Наличие фракции 1 вклегкьх проверяют в реакциях РПГЛ и РНАт

Синтез мышиного токсина, V-антиге- нз определяют в реакции диффузионной преципитации в геле, Са зависимость, способность к пигментсорбции, фибриноло- гическую, плазмокоагулазную активность и способность к синтезу пестицина I тестируют согласно руководству.

Существенное отличие заключается в трансформации микробных клеток плазмидой pFj-23, обеспечивающей в результате гомологичной рекомбинации с собственной плазмидой pFra/Tox элиминацию структурной части fra-оперона из микробной клетки; получение мутантов проеодитгя на полноценных питательных средах при температуре 2&°С - в наиболее физиологичных для культивирования Y, pestis In vttro услочиях,

Пример 1, Получение рекомбинант- ных плазмид.

Плазмида рЦС4К сконструирована Vieira J., Messing J. Плазмида pFsl получена нами путем клонирования 5,6-мегадаль- тонного Есо Ri-фрагменат плазмиды pFra/Tox из вакционного штамма Y. pebtls ЕВ линии НИИЭГ в составе известного кос- мидного вектора рНС7Э. На ее основе, за счет делецнк 0,8-мегадальтонного SalGl- фрагмента ДНК сконструирована плаими- да pFs2. Данные плазмиды несут в соагаьв клонированных фрагментов ДНК плазмиды pFra/Tox fra-оперон и обеспечивают при температуре 37°С образование белкозой капсулы (R антигена) в несуа их эти .

рукции клетках кишечной палочки и чумного микроба. Векторная часть плазмиды включает гены Арг, Тсг, а плазмида pFs2 несет лишь ген Арг, т.к. проведенная в процессе

ее получения делеция Sal Fi-фрагмептэ привела к инактивации гена Тсг,

Для получения плазмиды pFsSX ДНК pFsl гидролизовали рестриктазами Sal (ограниченный гидполиэ)и (полный гидро0 лиз), смешивали с Salll-фрагментом плазмиды pUC4K несущий ген устойчивости к камамицину, обрабатывали ДНК-лигазой фага 14, Полу ченным лигатом трансфорг.и- ровали клетки E.collH В 101, отбирали KmrTcr

5 клоны, выделяли плазмидную ДНК клонов. При получении плазмиды pFs 23 применяли сходные приемы, за исключением того, что делецию получали обработкой плэзмиды pFc2 рестриктазой Cla.reii Kmr из плазмиды

0 pUC4K встривали по сайту Benn Hi транс- форманты t, coil HB 101 отбирали по КтгАрг- признаку. Сконструированные таким образом плазмиды несут Kmr ген п имеют делецию внутренней области, обеспечиваю5 щей продукцию капсульного антигена.

Иммунологический анализ (РПГА и РНАТ)28 и37°-культур Е.-соМ сплазмидами pFsSx и pFs 23 показал полное отсутствие способности к синтезу капсульного антиге0 на в культуре с титром мк/мл. Результаты иммунологического анализа подтверждены троекратно.

Пример 2. Изучение механизма образования Рга -вариаитов.

5 Для этой цели использовали получанный Черепановым П. А. (ВНИИПМ) на основе вакционного штамма Y. pestis ЕВ 11ИИЭГ штамм Y. pestis ЕВ 100, содержащий лишь плазмиду, детерминирующую синтез Fl - и

0 Т-антигенов. Трансформация клеток Y. pestis EC 100 плазмидой pFs 23 позволила отобрать клоны KmrAps. Они составляли 1Ь% популяции трансформантов. Иммуно- химический анализ (РПГА, РНАТ) вариантов

5 Y. pestis ЕВ 100 с плазмидой pFs 23 показал полное отсутствие способности синтеза капсульного антигена в культуре с титром 5-10 мт/мл. Результаты иммунохимическо- го анализа подтверждены троекратно. Вы0 деленную плазмидную ДНК анализировали с помощью рестриктаз. Установлено, что плазмида содержит делецию и вставку Кглг- фрагмента в области, детерминирующей синтез капсульного антигена, как и предпо5 лагалось.

Использование плазмиды pFsSx для трансформации клеток Y. pestis ЕВ 100 не привело к появлению KrnrAps клонов.

Пример 3. Получение Рга -вариан- ТОБ штамма Y. pestis ЕВ НИИЭГ.

Клетки Y. pestis ЕВ НИИЭГ (2-суточнзя 28°-ная культура на агаре Хоттингера) трансформируют плазмидами pfs 23 и pFsSx. Отбирают Ктг-клоны, объединяют их и пассируют на иммунных белых мышах, вакцинированных подкожно введением 20 мкг коммерческого препарата F антигена за 3 недели до заражения, Эта процедура способствует завершению процесса речом- бинации и элюминации из популяции сохранившихся Рга+-клеток.

За сутки до заражения животным вводят внутрибрюшинно РеЗОл -ТНаО в подсолнечном масле (0,2 мл суспензии, содержащей 0,5 мг соли). Из органов павших животных делают высепы на агар Хоттингера, содержащий Km (25 мкг/мл), Отбирают клоны с фенотипом KmrAps. Использование плазмиды pFs 23 позволяет получить 50-80% клеток с данным фенотипом, 100% которых не способны продуцировать капсульный антиген Использование плазмиды pFsSx приводило к образованию рекомбинантных клонов лишь с фенотипом АргКглг. 25% из них были не способны к продукции капсульного антигена,

Пример 4, Оценка антигенного состава рекомбинантных клонов Y. pestfs ЕВ ВНИИЭГрРз23.

Наличие FI антигена проверяют о 100 клонах путем постановки серологических реакций РПГА и РНАТ 28° и 37°-ных культур, выращенных на агаре Хоттингера. FJ антиген отсутствовал в культуре с титром 5108 м-к/мл.

Синтез мышиного токсина и V-антиге- на определяют в реакции диффузионной преципитации в геле.

0

5

0

5

9 1

Са -зависимость, способность к пигмент-сорбции фибринолитическую плаз- мокоагулазную активности и способность к синтезу пестицина I тестируют согласно руководству, 100% клонов обладали фенотипом FraTnxV Lcr+PstfFlb fCaa+Psb.

Основным преимуществом предлагае- мсго способа является получение бескап- сульных вариантов чумного микроба, сохранивших все остальные фенотипиче- ские признаки исходных штаммов. В их геноме происходит лишь целенаправленное .замещение структурной части fra-оперона п генблок детерминирующей синтез кана- мицинфосфотрансферазы.

Способ применяется в генетических исследованиях Y. pestis для изучения ролЈ. антигена фракции Г в биологии этого микроорганизма и для получения плазмид pFra/Tox, маркированным геном антибио- тикоустойчивости в заранее выбранном сайте,

Способ не требует дорогих реактивов и занимает мало времени.

Формула изобретения Способ получения мутантов чумного микриба дефектных по синтезу капсульного антигена фракции I, предусматривающий выращивание клеток чумного микроба на питательной среде, отбор м/тантов, содержащих плазмиду pFra/Tox с делецией в генах, ответственных за синтез капсульно- го антигена, отличающийся тем, что, с целью повиыеьия выхода мутантов со строго определенными делециями, в клетки чумного микроба вводят плазмиду pFs 23, а мутанты отбирают по KmR Aps фенотипу.

Изобретение относится к бактериальной генетике. Целью изобретения является повышение выхода мутантов чумного микроба со строго определенными делециями Способ заключается в использовании гибридной плазмиды pFs 23, которую вводят в клетки чумного микроба с последующим отбором бескапсульных вариантов по KmRAps фенотипу