Способ получения реагента для иммунохимического анализа Советский патент 1984 года по МПК G01N33/50 

о: |

4:: 4

СО Изобретение относится к биохимии и касается способа получения реаген тов для иммунохимического анализа широкого круга биологически активных веществ - белков, лекарственных препаратов , стероидных и пептидных гормонов в биологических жидкостях, в частнсзсти в сыворотке крови. Известные реагенты для иммунохимическо -о arfanHsa получают ковалент ным связыванием соответствующего антигена или гаптенового органического соединения с молекулой веще ства, выполняющего роль детектора иммунохимической реакции.Гаптеновыми соединениями называют органические вещества, которые не дают самостоятельно иммунной реакции, но при связывании с иммуногённым носителем вызывают специфическое образование антител к данному гаптену, причем в качестве метки (детектора ) используют радиоактивные изотопы ClJ, молекулы-, способные флуоресцировать под действием определенных агентов C2 ферменты-лизоцим З, оксидоредуктазы f4 . &лбор способа получения ковалентного конъюгата антигена или гаптенового соединения с молекулой детектора определяется как природой антигена или гаптена, так и строением химического вещества, используемого в качестве детектора или метки иммунохимической реакции. Наиболее близким, к предлагаемому является способ получения реагента для иммунохимического анализа путем взаимодействия гапте.нового органического соединения с веществомдетектором иммунохимической реакции, в качестве которого используются ферменты - оксидоредуктазы, а пронес ведут при участии изобутилового эфира угольной кислоты.-В качестве гаптеновых соединений используют различные биологически активные вещества - наркотики, барбитураты. транквиллнзаторы, стероидные и пепти ные гормоны 4. Недостатком данного способа являет-ся то, что для большинства получаемых реаге 1тов чувствительность не превышает . Максимальная чувствительность 5 1. получена при определении морфина и его аналогов. Цель изобретения - повышение чувствительности получаемого реагента. Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения реаге та для иммунохимического анализа, заключающимуся во взаимодействии гап стенового органического соединения с веществом-детектором иммунохимической реакции,,в качеётве вещества-деjg KTQpa используют М - (б-аминогексил )аиетамидное производное никотинамидлдениндину1слеотида или (6-аминогексил/J ацетамидное производное аденозинтрифосфата, предварительно модифицированное водорастворимым карбодиимидом. Образование химической связи между молекулой кофактора и антигена и отсутствие в конечном продукте свободных молекул НАД и антигена доказано использованием ряда физико химических методов-спектрофотометркчески, газожидкостной хроматографией, электрофорезом в капилляре {изотакофорез|. В качестве растворимого карбол / да могут быть использованы любые про дажные препараты карбодиимидов, содержащие третичные или четвертичные аминогруппы, например мета-пара-толуолсульфонат- N -циклогексил- N-- 2-морфолинил-(4 )-зтил -, N -циклогексил- N-(h-диэтиламиноциклогексил)- или 1-этил3 (З-диметил-аминопропилI карбодиимиды. Условия проведения реакции и молярные соотношения реагентов являются одинаковыми для всех при веденных карбодиимидов. Выбор мета-пара-толуолсульфонат-Ы-цйклогексил -М- 2-морфолинил-(4)-этил- карбодиимида связан не с его преимуществами как реагента, а с его высокой стабильностью.. .Другие продажные карбодиимиды могут быть использованы только в свежеприготовленном виде. Значение рН определяется природой связываемого соединения и может варьироваться в довольно широких пределах рН 4-8 . Мольное соотношение реагентов 1:1, так как реакция, протекает стехиометрически. Химическую модификацию АТФ проводят следующим образом. АТФ обрабатывают в течение 5-7 дней в темноте литиевой солью монойодуксусной кислоты. Образующееся при этом .N-карбоксилительное -производное нагреванием в слабощелочной среде (рН 8,5 переводят в аналогичное М°-производное. К полученному продукту добавляют последовательно раствор гексаметилендиаминдигидрохлорида и мета-пара-толуолсульфонат N-циклогексил-N- 2-Mopфолинил- (4 )-этил -карбг диимида , поддерживая в реакционной смеси рН 4,5-5,0. АТФ-Ы - М - 6-аминогексилЗ -ацетамид выделяют хроматографически на колонке с катионообменной смолой. Получение N° -(6-аминогексил/ацет амидного производного НАДа осуществляют по известной методике fS. Предлагаемым способом могут быть получены конъюгаты АТФ и НАД с ишроким кругом гаптеновых биологически активных веществ, в том числе стероидными и пептидными гормонами, аминокислотами, пептидами, целым рядом лекарственных преПаратов, например транквилизаторами, антибиотиками и т.д.

Способ обуславливает получение реагентов, чувствительность которых при определении соответствующих соединений составляет 10®-10 м Пример. Получение ЛТФ-Ы .-{N -(б-аминогексилЛ ацетамида.

5 г АТФ (8,3 ммоль) добавляют к 100 мл водного раствора монойодуксусной кислоты (15 г, 80 ммольJ, предварительно нейтрализованной 2М раствором Li ОН до рН 6,5 и инкубируют в темноте при 30°С в течение семи дней, поддерживая рН 6,5. Полученный N-карбоксиметил-АТФ осаждают добавлением к реакционной смеси 800 МП охлажденного .до этанола, вьшавший осадок отделяют, промывают этанолом, эфиром и сушат под вакуумом. Выход М -карбоксиметил-ЛТФ составляет 90%. 100 глл

водного раствора N-карбоксиметил-ЙТФ нагревают при температуре 90°С в течение 1,5 ч при рН 8,5. Полученный раствор N -карбоксиметил-АТФ охлаждают, доводят 1 М раствором НС рН до 2,75 и наносят на колонку с Dowex 1-2(СГ) (2,5-60 см), промывают 0,3 М раствором LiCl, рН 2,75. Для элюирования продукта используют, линейный градиент 0,3 М LiCl, рН 2,75 и 0,5 М LiCl, рН 2,0 (общий объем элюирующего раствора4л . Элюат нейтрализуют 1 М раствором Lii ОН и концентрируют на роторном испарителе до объема 6Q мл. Выход N -карбоксиметил-АТФ составля. ет 52%. К 60 мл N -карбоксиметил-АТФ добавляют 80 мл 1 М раствора гёксаметилендиамйн дигидрохлорида и 5 мл водного раствора мета-пара-толуолсульфонат N -циклогексил- N - 2-морфолинил-(4 )-этил карбодиимида (3,24 г, 7,6 ммоль). Реакцию проводят при комнатной температуре в течение 1 ч при рН 4,7-5, Продукт осаждают 1,5 л охлажденной смеси ацетон-этанол(1:II . Осадок отделяют, растворяют в 60 мл

воды, доводят с помощью НС рН до

5 и наносят на .колонку с Dowex

1-2 (сГ) (2,5-6.0 см). Колонку предварительно лромывают 100 МП 0,05 М раствора LiCP, рН 5, Конечный продукт элюируют линейным градиентом (0,05.М Lice с рН 6 и 0,35 М с рН 2 при общем объеме 4 л . Элюат нейтрализуют, концентрируют на роторном испарителе до объема около 50 мл и осаждают 500 мл охлажденной смеси этанол - ацетон (1:1). Выход АТФ-М- Ы- 6-ами ноге к си л) ацетамида составляет 58%.

П р и М е р 2. Получение конъюгата АТФ-М - М-(6-акшногексил )-ацетамид инсулин.

Раствор, содержащий 30 мг АТФ- (6-аминогексил) ацетамида, ,

6 мг инсулина и 42 мг мета-пара-толуолсульфонат N-циклогексил-N-f2-. -морфолинил-(4 ) карбодиимида в 5 мл 0,1 М трис.-ацетатного буфера, (рН 8,4), инкубируют 3 ч при 20°С

и оставляют на ночь при.+4с. Комплекс выделяют гель-хроматографией на колонке (1,030 см) с сефадексом G -50; уравновешенным 0,1 М трис,-ацетатным буфером (рН 8,4), ПолуQ ченные фракции контролируют спектрофотометрически, отбирая фракции, обладающие поглощением на267 и 280 нм.

П р и М е р 3. Получение конъюга. та - (б-аминогексил) -ацетамид тироксин,

5 9,8 мг ATФ-N - N-(6-aминoгeкcил)} - -ацетамида и 9,5 мг тироксина раст-воряют в 5 мл 0,1 М ацетатного буфера, рН 4,4, К полученному раствору добавляют 6 мг мета-пара-толуол0 сульфонат N-циклогексил-N- 2-мор«фолинил-(4 )-этилJкapбoдиимидa. .Реакцию ведут 24 ч при , поддерживая с помощью 0,1 М раствора НС, рН 4,8. Полученный комплекс выделяют

5 на колонке с сефадексомG 10, уравновешенной ацетатным буфером. Отбор фракций контролируют спектрофотометрически.

П р им е р 4,. Получение конъюга0 та (6-аминогексил )-ацетамид ампициллин.

12 мг ATФ-N - N-(6-aминoгeкcил) -ацетамида и 3 мг ампициллина растворяют в 6 мл трис.-ацетатного бу- фера (рН 7,8 ) и к полученному раст- : вору добавляют 7 мг мета-пара-то- . луолсульфонат- N-циклогексил- Ы- 2-морфолинил-(4 )-этил карбодиими.да. Реакцию ведут при комнатной температуре, поддерживая 0,1 М раство0 ром НС значение рН до 6. Реакционную смесь оставляют на ночь при температуре +4°С и затем вьщеляют конъюгат гель-фильтрацией-на колонке с сефадексом , уравновешенной

5 М трис.-ацетатным буфером,

рН 7,8. .,

П р и М е р 5, Получение контюгата АТФ-Ы - М-(б-аминогексил )-ацёт-. амид -17-/3 -эстрадиол. 0 К 2,8 мл 10- М раствора АТФ-N°- N - (6-аминогексил -ацетамида в 1дистиллированной воде добавляют 1 мл 2 раствора мета-пара-толуолсульфонат N -циклогексил-N 2-морфолинил-(4 )-этил карбоди

имида и 2 мл водного раствора 17-/i -эстрадиол ( о -карбрксиметил) оксима, 0,1 М раствором НСб доводят рН до 4,8, Реакцию проводят при комнатной температуте в тече0 ние 2 ч, а затем при температуре 4°С в течение суток. Полученный ковалентный конъюгат АТФ-17- -эстрадиол выделяют на колонке с сефадексом G 10, уравновешенным 0,1 М

5 трис.-ацетатным буфером, рН 7,8, П р и м е рб. Синтез N -(б-аминогексил)ацетамида НАД. 10 г НАД (15,1 ммоль/ добавляют к 135 МП водного раствора монополукеусной кислоты (30 г, 150 ммол предварительно нейтрализованного 2 М раствором Not ОН, рН раствора доводят до 6,5 и инкубируют в темноте две недели, постоянно поддерживая рН 6,5. Через 14 дней раствор подкисляют 6 М раствором HCf до рН 3,0, добавляют 250 мл этанола и рас вор вливают в колбу, содержащую 1,5 л охлажденного до 0°С этанола, при интенсивном перемеишвании. Выпадающий осадок фильтруют, промывают этанолом, эфиром и высушивают под вакуумом. Получают приблизитель но 12 г светло-розового продукта. 12 г N -карбоксиметил-НАД растворяют в 300 мл 2%-ного раствора NaHCOj, рН доводят до 8,5 и через раствор пропускают аргон. Затем для перевода кофактора в восстанов ленйую форму добавляют 5 г дитионита натрия и оставляют стоять fe темноте 2 ч при комнатной температу ре, после чего пропускают в -течение 10 мин кислород и 3 мин аргон. Перегруппировку N-карбоксиметил-НАД.Н в N -карбоксиметил-НАД.Н .|рсумествляют при Нагревании до 75С в течение 1 ч при рН 11,5. Окисленную форму модифицированного кофактора получают ферментативным спо- . собом: добавляют к раствору кофактора 20 мЛ 2 М трис.-НСЙ, 5 млацетальдегида, 3 М НС до рН раствора 7,5 и 5 мг црожжевой алкогольдегидрогеназы (2500 ед ) . За окислением следят спектрофотометрически при длине волны 340 нм. После прекращения реакции доводят рН до 3,5 и добавляют один объем эта- . НОЛа. Затем раствор вливают в 10-кратный избыток этанола при энергичном перемешивании и суспензию оставляют в холодильнике на ночь. Осадок, содержащий М -карбоксиметил-НАД, фильтруют, промывают этанолом, эфиром и высуши вают. Готовый продукт очищают ионо обменной хроматографией на колонке с «Dovex 1-4 (СГМ2,5-70 см), на которую наносят раствор модифициройанного кофактора (рН 8,0/, пррмы,вают дистиллированной водой (500 1лл) 1И 0,005 М раствором СаСе (рН 2,7F до тех пор, пока рН элюата не принимают зна.чение 2,9 (2,5 л). Для элюированйя конечного продукта используют линейный градиент рН -и концентрации соли (.0,005 М CaCtj ; рН 2,0, общий обием 8 л ). Элюат нейтрализуют Си(ОН)2 и концентрируют на роторном испарителе. Очищенный продукт осаждают этанолом. Выход продукта около 40%.

комнатной температуре в .течение 2 ч, а затем при температуре 4°С . в течение суток. Полученный ковалентный конъюгат НАД-инсулин выделяют на колонке с сефадексом Cis50, уравновешенной дистиллированной

5 водой. Содержание конъюгата в различных фракциях контролируют спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность раствора при длинах волн 266 и 280 нм. Одна молекула НАД связывается с одной молекулой инсулина,

П р и мер 8. Получение конъюгата НАД-тироксин,

10 мг (6-aминoгeкcил aцётaмид-HAД и 9 ,5 мг тироксина расворяют5 в 5 мл 0,1 М ацетатного буфера, рН 4,4, К полученному раствору добавляют 6 мг мета-пара-толуолсульфонат N -циклогексил-М-f2-морфолинил-(4 |-этил карбодиимида и рН

доводят до 4,8 0,1 н. раствором НС, Реакцию проводят при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем при температуре 4°С в течение суток. Полученный конъюгат НАД-тироксин

5 мольного состава 1:1 выделяют на

колонке с сефадексом G 10 (1,250см|, уравновоиенной дистиллированной водой.

П р и м е р 9. Получение комплекса НАД-ДОФА диоксифенилсшанин.г

10 мг Nb- (6-аминогексил1ац6тамид-НАД и 2,4 мг 1, -диоксифенилаланина (ДОФА ) растворяют в 5 мл дистиллированной воды. К полученному раст5 вору добавляют 6 мг мета-пара.-толуол3М -карбоксиметил-НАД (200 мг) растворяют в 4 мл раствора солянокислого гексаметилендиамина (1,2,г|, К раствору небольшими порциями добавляют мета-пара-толуолсульфонат N -циклогексил- N -f2-морфолинил- (4 )-этил карбодиимид (176 мг ) ц рН доводят до .4,8-0,1 н. раствором HCI. Реакцию проводят при комнат;1Ой температуре в течение суток. Реакционную смесь освобождают от к рбодиимида и гексаметилендиамина в колонке с сефадексом G 10 {1,2-50 см) уравновешенной дистиллированной кодой. Фракции, содержащие нуклеотид, объединя1от, рН доводят до 7 и раствор пропускают через колонку с Dowex 50 W -4 ( (1-4 см). Чистый продукт получают осаждением этанолом. Выход продукта 50%. . П-р и м ер 7. Получение конъюгата НАД-инсулин. К 2 мл раствора N -(б-аминогексил )ацетамид-НАД в дистиллированной воде добавляют 1 мг мета-пара-толуолсульфонат Ы -циклогексил-N- 2-морфолинил-(4|-этил карбодиимида и. 1 мл водного раствора инсулина, рН доводят до 4 8 0,1 н. раствоЕюм НС2. реакцию проводят при

СПОСОБ ПОЛУЧЕН1М РЕАГЕНТА ДЛЯ ИММУНОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА путем взаимодействия гаптенового органического соединения с веиеством-детектором икмунохимической реакции, о т л и ч. а ю ш и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности реагента, в качестве вещества-детектора используют N -{6-аминогексил)-ацетамидное производное никотинамидадениндинуклеотида или N