Способ выявления микобактериального антигена Советский патент 1992 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к иммунологии, а именно к диагностике инфекционных болезней.

Цель изобретения - повышение точности способа.

Пример 1. Постановка реакции латекс-агглютинации с антигеном из M.smegmatis.

К 0,5 мл 0,1 %-ной водной суспензии латекса АКР-2 (рН 7,6-7,8) добавляют 10,0 мг у-глобулина, выделенного из гипериммунной кроличьей антисыворотки к M.smegmatis. Смесь инкубируют в течение 3 ч при комнатной температуре с осторожным помешиванием. Сенсибилизированный латекс осаждают центрифугированием при 3000 об/мин и отмывают от несвязавшегося утлобул1 на бидистиллированной водой (рН 7,6-7,8) однократно. Свободные альдегидные группы латекса блокируют 1 %- ным водным раствором глицина (рН 8,6-8,8)

в течение 30 мин при комнатной температуре. Полученный конъюгат суспендируют в 2,5 мл 1%-ного раствора глицина (рН 8,6- 8,8). Контрольный коньюгат - латекс после инкубации в течение 30 мин прш комнатной температуре в 1 %-ном водном растворе глицина. Постановку реакции проводят в планшетах для иммунологических реакций. Антиген готовят из M.smegmatis путем ультразвукового разрушения бактериальных кле ток. Концентрация белка в первой лунке 100 мкг. Титрование до разведения 1:1024 проводят двухкратным разведением его 1 %- ным водным раствором глицина (рН 8,6). В каждую лунку с 50 мкл раствором антигена добавляют по 50 мкл антительного латекс- ного диагностикума.

Контроль: 50 мкл сенсибилизированного латекса и 50 мкл 1 %-ного водного раствора глицина (рН 8,6);

сл

с

50 мкл контрольного латекса и 50 мкл 1 %-ного водного раствора глицина (рН 8,6);

20 мкл контрольного латекса и 50 мкл раствора антигена в первом разведении.

В реакции с сенсибилизированным латексом агглютинация с образованием зонтика (+++) наблюдалась в титре 1:32, зонтик (++) - в титре 1:64, кружок (+) - е титре 1:128.

В контрольных пробах все реакции отрицательные (осадок в виде точек).

П р-и м е р 2. К 5,0 мл 0,1 %-ной водной суспензии латекса (рН 7,6) добавляют 10,0 мгу-глобулина, выделенного из гипериммунной кроличьей антисыворотки к M.avium, Смесь инкубируют в течение 3 ч при комнатной температуре, осторожно помешивают. Сенсибилизированный латекс осаждают центрифугированием при 3000 об/мини отмывают от несвязавшегося у-глобулина бидистиллированйой водой (рН 7,6) однократно. Свободные альдегидные группы латекса блокируют 1 %-ным водным раствором глицина (рН 7,6) в течение 30 мин при комнатной температуре. Полученный конъюгат суспендируют в 2,5 мл 1 %-ного водного раствора глицина (рН 8,8). Контрольный конъюгат-латекс после инкубации в 1%-ном водном растворе глицина (рН 7,7) в течение 30 мин при комнатной температуре. Антиген из M.avium .готовят путем ультразвукового разрушения бактериальных клеток. Концентрация антигена в первой лунке 200 мкг. Титрование антигена проводят 1 %-ным водным раствором глицина (рН 8,8) способом двукратного разведения, В каждую лунку с 50 мкл раствора антигена добавляют по 50 мкл антительного латексного диагностикума. Контрольные постановки реакции латекс-агглютинации, как-в примере 1. .

Агглютинация частиц латекса наблюдалась до титра 1:512.

В контрольных пробах все реакции были четко отрицательные (осадок латекса в виде точек).

П р и м е р 3. К 0,5 мл 0,1 %-ной водной суспензии латекса (рН 7,8) добавляют 10,0 мкгу-глобулина, выделенного из гипериммунной кроличьей антисыворотки к M.vallae, Дальнейшая обработка латекса, как в примере 2. с использованием для отмывки, коньюгата бидистиллированной воды (рН 7,8), а для блокирования свободных альдегидных групп - 1 %-ного водного раствора глицина (рН 7,8). В качестве рабочего используют 1%-ный водный раствор глицина (рН 8,8). Реакцию латекс-агглютинации проводят с суспензией клеток БЦЖ, концентрация которых в первой лунке 75 мкг. Постановка реакции и контроль, как в примере 1.

Агглютинация частиц латекса наблюдалась до концентрации бактериальных клеток 4,5 мкг.

В контрольных пробах все реакции были четко отрицательные (осадок латекса в виде точек).

Сравнительная постановка реакции агглютинации латекса с антительным латекс- ным диагностикумом, полученным сенсибилизацией антителами против M.bovis в водной среде (рН 7,8), осуществляют с антигенными препаратами из M.bovis, BCG, М.tuberculosis, M.avium, M.iortuitum, M.smegmatisl.

По предлагаемому способу (разводящая жидкость: 1%-ный водный, раствор глицина,

рН 8,6), а по известному способу разводящая жидкость: 1%-ный раствор глицина в 0,85%-ном растворе NaCI, забуференном фосфатным буфером, рН 8,6.

Исходная концентрация белка в исследуемых дезинтегратах микобактерий 2 мг/мл; исходная концентрация микобак- териальных клеток 1,5 мг/мл.

Полученные результаты приведены в таблице.

Результаты реакции контрольного латекса с исследуемыми препаратами по предлагаемому способу во всех реакциях были отрицательными. В сравниваемом способе во всех разведениях с контрольным

латексом наблюдалась спонтанная агглютинация.

Таким образом, сенсибилизация латекса антителами в бидистиллированной воде и постановка реакции в водным растворе

глицина позволяет повысить специфичность реакции латекс-агглютинации за счет ликвидации явлений спонтанной агглютинации.

Формула изобретения

Способ выявления микобактериального антигена, включающий сенсибилизацию латекса антителами при рН 7,6-7,8, блокаду свободных альдегидных групп глицином

при рН 7,6-7,8, смешивание полученного диагностикума с раствором исследуемого микробного дезинтеграта при рН 8,6-8,8 и учет результатов по агглютинации латекса, отличающийся тем, что, с целью

повышения точности, сенсибилизацию латекса проводят в бидистиллированной воде, а перед смешиванием диагностикум и микробный дезинтеграт разводят в 1 %-ном водном растворе глицина.

из M.for-

из М.smeg-

+++

++++ ++++ +++ +++

+++

+++ +-Н+-Н++++

+++

+++

++

-Н-+

++

+

++

-нч- +++

+ Mil +++ +++ +++ +-Ы+++++++

Исследуемый антигенный препарат

Постановка реакции латекс-агглютинации по .способу при разведении

Использование: иммунология, диагностика инфекционных болезней. Сущность изобретения: к 0,1 %-ной водной суспензии латекса АКР-2 рН 7,6-7,8 добавляют у-глобулйн, выделенный из гипериммунной кроличьей антисыворотки к микобактериям. Смесь инкубируют Зч при комнатной температуре. Сенсибилизированный латекс осаждают центрифугированием от несвязавшегося у-глобулина, отмывают бидистиллиро- ванной водой рН 7,6-7,8 однократно. Свободные альдегидные группы латекса блокируют 1 %-ным водным раствором гли- цирина рН 8,6-8,8 в течение 30 мин при комнатной температуре. Полученный конъ- югат суспендируют в 1 %-ном растворе глицина рН 8,6-8,8. Постановку реакции агглютинации латекса осуществляют в 1%- ном водном растворе глицина. 1 табл.

1/2 ) 1/4 1 1/8 j 1/16 1 1/32 I 1/6V 1/2 I /k 1 1/8 1 1/16 1/32 | 1/6i

is

++++ ++++ +++ ++++ ++++ +++ ++++ +++ +++

Примечание. ++++ зонтик на полную лунку; +++ зонтик с четко очерченными краями; ++ кружок с рыхлым

осадком а центре; 4- осадок в виде рыхлой,точки - осадок в виде точки + результат между +

сомнительный

Предлагаемый

Известный

-j

4-4+

++

++

+ +

+++++++ .++4-+4-44-4-4-4-+4-4-4-4-4-+4-4++++++4-Ф4-4-+44+++++++4-++++++

+++++++++++++++

++++++ .

++++++++

++++++

+++ +++

+++++++

-j го со ел го ст

+++ +++

+++ +++

+++ +++

+++ +++

+++ +++.

+++ +++

+++++ ++++ +++

+++ +++

++++ +++

кружок с рыхлым

сомнительный

со