Способ количественного определения биологически активного вещества Советский патент 1983 года по МПК A61K39/00 G01N33/48 

ю

ч|

го

СПОСОБ КОШЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ. БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО BE- , ЩЕСТВА путем инкуба 1(ии исследуеного материала со специфической сывороткой в присутствии меченого исследуемого биологически активного вещества, взятого в определенной концентрации, с последуяицим учетом непроре-. агировавфего меченого вещества, о тл и ч а ю щ и и с я тем, что, с . целью пог11аа}ения чувствительности способа, инкубирование проводят в присутствии биологически активного веществг, меченого никотина-мидаденин динуклеотидом или аденозинтрифосфатом..

Iff-tt

Ггf

капавня ан uHtyau,

Изобретение относится к медицине и касается способа количественного определения биологически активного вещества.

Известен способ количественного определения антигена с помощью флюоресцирующих красителей

Известен также способ количественного определения биологически активного вещества (ВЛВ) путем инкубации исследуемого матери-ла со специфической сывороткой в присутствии меченог исследуемого БАВ, взятого в определенной концентрации с последующим учетом количества непрореагировавшего меченого веи ества. Чувствительность для

стероидных гормонов 10 м, на 2.

для инсулина

Однако известный способ не обеспечивает высокой чувствительности спо соба.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа.

Цель достигается тем, что согласно способу количественного определения биологически активного вещества путем инкубации исследуемого материала со специфической сывороткой в присутствии меченого исследуемого биологически активного вещества, взятого в определенной концентрации, с последующим учетом количества непрореагировавшего меченого вещества, инкубирование проводят в присутствии биологически активного вещества, меченого никотинамидадениндинуклеотидом или аденозинтрйфосфатом.

Меченое НАД БАВ получают путем модификации НАД гто Cg - аминогруппе аденинового кольца с последующим связыванием модифицированного кофермента с БАВ карбодимидом.

Пример Г. Определение инсулина.

Построение калибровочной кривой для определения инсулина в растворе.

1 мл раствора инсулина в фосфатном буфере рН 7,8 , содержащем стандартные количества (0,05; 0,1; 0,5; 1,5; Ю; 20; kG; 60; 100 и 200 нм инсулина, инкубируют с 200 мкл имунной сыворотки морской свинки против инсулина свиньи, разведенной в 1000 раз и 1 мл раствора комплекса НАД - инсулин (никотинамида-дениндинуклеотид-инсулин) в течение 2-25 мин при .

После инкубации 0,1 мл раствора инкубационной смеси вносят в кювету спектрофотометра, содержащую 1,9 мл 0,05 М калий-фосфатного буфера рН 7,,0,1 мл смеси НДМА (паранитрозо-N N-диметиланилин) и циклогексанола/НДМА растворяют в циклогексаноле до концентрации 40 мМ,а за- 0 тем разбавляют 0,05М калий-фосфатным буфером до концентрации 300 мкМ/мл и 0,1 мл алкоголегидрогеназы. Измеряют убывание восстановленной формы НДМА по изменению опти5ческдй плотности при kkO нм. Калибровочная кривая представлена на фиг.1 . Определение инсулина осуществляют следующим образом.

1 мл сывооотки крови человека, разведенной в 10 раз калий-фосфатным буфером, инкубируют с 200 мкл сыворотки морской свинки, содержащей антитела к инсулину, разведенной в 100 раз и 1 мл Ю М раствора НАД 5 инсулин, после чего вносят в кювету спектрофотометра для измерения скорости восстановления НДМА. Все остальные реагенты добавляют в тех же соотношениях, что и при построении калибровочной кривой. Определяют концентрацию инсулина по калибровочной кривой .

Пример 2. Определение 17-Й-экстрадиола.

c Для построения калибровочной кривой 1 мл раствора 17-)Ь-экстрадиола в 0,05 М калий-фосфатном буфере (рН 7,8), содержащий стандартные количетсва Ю,; 0,8; 1; 1,5; 2,10; 20;

0 50 и 100 нг) инкубируют с 1 мл М раствора комплекса НАД-17-fb-3KCTpaдиола с бычьим сывороточным альбумином (БСА) разведенным в 100 раз, в течение 20 мин при . Доза и разведение антисыворотки подбирают по ингибированию скорости восстановления НДМА на 60.

Определение 17-(- экстрадиола осуществляют аналогично примеру 1.

Чувствительность определения биологически активных веществ достигает 10, . п, в частности для инсулина ю м.

Для получения комплексов аденос зинтрифосфат (АТф) с БАВ АТФ предварительно модифицируют до АТФN -N -(6-аминогексил)-ацетамида и затем ковалентно связывают с соотIветствующим биологически активный веществом в присутствии растворимого карбодиимида. Пример 3. Определение инсулина. Построение калибровочной кривой . 1 мл раствора инсулина в О,1 М трис- ацетатном буфере (рН 7,8, содержащем стандарнтные количества (5; 10; 20; 60; ТОО и 20 нг) ин сулина инкубируют со 100 мкл иммунной сыворотки мор1ской свинки против инсулина свиньи, разведенной в 1000 ра и 1 мл раствора комплекса АТФ-инсулин в течение 20-30 мин при . Для работы используют объем и раз ведение исходной антисыворотки, вызывающей ингибирование биолюминесценции 1 мл 10 М раствора комплек са АТФ-инсулин на 80. После инкубации 0,5 мл реакционной смеси вносят в кювету биолюминометра, содержащую 1 мл 0,1 М трисацетатного буфера, рН 7,8; 0,2 мл 0,1 М раствора MgSO, 0,2 мЛ О, м раствора люцеферина и 0,2 мл раствора люцефйразы в том же буфере и измеряют интенсивность биолюминесценции. Калибровочная кривая представлена на фиг.2. По получении калибровочной кривой может быть определено содержание ин 1 4 сулина в образце биологической жидкости, 1 мл сыворотки крови человека, разделенной в 10 раз.(Р«1 мл сыворотки и 0,9 мл трис-ацетатиого буфера, рН 7,3) инкубируют со 100 йкл имунной сыворотки морской свинки, разведенной в 1000 раз, и 1 мл 10 М раствора комплекса АТФ-инсулин в течение 20 мин при , после чего 0,5 мл реакционной смеси вносят в кювету для измерения интенсивности биолюминесценции. Все остальные реагенты добавляют в кювету в тех же соотношениях, что построении калибровочной кривой. По полученному значению интенсивности с помощью калибровочной кривой определяет концентрацию инсулина.Чувствительность определения около 10 Н. Пример 4. Определение концентрации ампициллина. Для проведения иммунной реакции используют антисыворотку, полученную к конъюгату ампициллин-бычий сывороточный альбумин (БСА), доза и разведение которой подбирают экспериментально в зависимости от активности и титра антител. В качестве меченого стандарта используют 10 М раствор комплекса АТФ-ампициллин. Использование способа позволяет повысить чувствительность (Х1ределения, сократить время проведения анализа .

Концентраций инсулина, mim

5 Фия г.