Способ определения фентанила в водных растворах Советский патент 1993 года по МПК G01N33/53 

у

Ё

Использование: в иммунологии, в частности относится к иммунохимическому анализу, и может быть использовано для определения фентанила. Сущность изобретения: для иммуноферментного определе; ния фенталина кроличьи антитела к коныогату бычьего сывороточного альбумина и карбоксифентанила, полученному в реакции смешанных ангидридов и имеющему эпитопную плотность 12, взаимодействующие с твердофазнымтест-антигеном, в качестве которого используют с коньюгат гамма-глобулина лошади с карбоксифента- нилом, полученный в реакции смешанных ангидридов и имеющий эпитопную плотность 29. Способ позволяет проводить определение фентанила с чувствительностью 2,5-10 ммоля в пробе. 1 табл.

Изобретение относится к иммунохимии и может быть использовано в клинической медицине для количественного определения фентанила.

Одним из наиболее высокочувствительных методов определения фентанила является его радиоиммуноанализ с чувствительностью 1 пмоль (336 пг).

Цель изобретения - повышение чувствительности определения фентанила.

Цель достигается .использованием для иммунизации конъюгированного антигена, синтез которого, в отличие от описанного для прототипа осуществляют не при помощи водорастворимого карбодиимида, а взаимодействием смешанного ангидрида карбоксифен.танила и изобутилхлорфор- миата с бычьим сывороточным альбумином. Применение для иммунизации такого антигена позволило получить антитела, минимальное ингибирование связывания которых в твердофазком иммуноферментном анализе имело место при добавлении в пробу 2,5 10 ммоля свободного фентанила, что и определило чувствительность способа.

Пример. Синтез ran гена гемисукци- ната М-фенил-М-4-{1-(2-фенил-этил)пипери- дина карбоксифентанила). 1,2 г (0,043 моль) М-фенил-М-4- 2-фенилэтил)пиперидина растворяли в 20 мл толуола, прибавляли 0,45 г (0,045 моль) янтарного ангидрида в 30 мл толуола и нагревали под аргоном в течение 20 часов. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали эфиром и перекристалли- эовыэели из смеси бензол: гексан (3 : 2). Выход 1 г (61,3%). Т.пя 188,3°С, Элементный анализ. Найдено: С 72,16 Н 6,9 N 6.78

00

ю

ё

00

С2зН28№Оз. Вычислено: С 72,61 Н 7,39 N 7,42. ИК 1720, 1640(С 0)

Синтез иммуногена. К раствору 0,17 г (0,0456 ммоль) карбоксифентанила в 1,5 мл диметилформамида, охлажденного 0 - 2°С, добавляли 50 мкл (0,456 ммоль) М-метилмор- фолина и при перемешивании на магнитной мешалке прикалывали 59 мкл (0,456 ммоль) изобутилхлорформиата. Реакционную смесь перемешивали 30 мин и затем постепенно добавляли к охлажденному до 0-2°С раствору 0,50 г (0,075 ммоль) бычьего сывороточного альбумина в 50 мл борно-борат- ного буфера рН 9. После перемешивания в течение 1 ч при 0-2°С и 18-20 ч при 8°С реакционную смесь центрифугировали (7000 об, 15 мин). Белковую фракцию отделяли от низкомолекулярных компонентов гель-фильтрацией на колонке с сефадексом Г-25 (5 х 30 см), уравновешенном 0,01 М натрий-фосфатным буфером рН 8, содержащим 0,15 М хлористого натрия, концентрировали до объема 10мл вульт- рафильтрационной ячейке Амикон с фильтром ХМ-50, промывали несколько раз дистиллированной водой и лиофильно высушивали. Получали 0,50 г (100% по белку) иммуногена, содержащего 12 молей гаптена на. моль белка. Молярную нагрузку (зпитоп- ную плотность) определяли спектрофото- метрически (А 340 нм, Егапт 458, Оконьюг 0,34 при С 2,67 мг/мл).

Синтез тест-антигена. Из 0,071 г (0,19 ммоль) карбоксифентанила в 0,5 мл диметилформамида, 21 мкл (0.1S Ммоль) N-ме- тилморфолина, 24 мкл (0,19 ммоль) изобутилхлорформиата и 0,50 г гаммаглобу- лина лошади в 50 мл борно-боратного буфера рН 9 по описанной выше методике получали 0,60 г образца, содержащего 16% солей с эпитопной плотностью 29 (А 340 нм, Оконъюг 0,17 при С « 2,89 мг/мл). Выход по белку составил 99%.

Антисыворотку получали из крови кроликов, иммунизированных конъюгатом бычий сывороточный альбумин - карбок- сифентанил в количестве 5 мг на животное в полном адъюванте Фрейнда в 20-30 точек области спины подкожно и через кажды.е 3-4 недели по 10 мг в физиологическом растворе, также в 20-30 точек области спины. Через 7 дней после каждого введения иммуногена, начиная со второго, у животных брали кровь, отделяли сыворотку, которую использовали в имму- ноферментном анализе в количествах, обеспечивающих оптическую плотность субстратной смеси 0,5-1,6, Титр антисыворотки составил 1 : 1024000.

Проведение анализа. В каждую из 96 ячеек полистироловой пластины вносят 0,01 мкг коньюгата гамма-глобулин лошади - карбоксифентанил в 0,2 мл 0,05 М карбонат-бикарбонатного буфера рН 9,5, После инкубации в течение 18 ч при 4°С плату отмывали 0,15 М раствором хлористого натрия, содержащего 0,05% твин-20. В ячейки заливали 0,1 мл раствора фентанила в диапазоне концентраций от до ммоль в пробе и затем по 0,1 мл антисыворотки в количестве 0,4 мкг по белку, то есть, разведенную в 150000 раз. Контрольными являлись ячейки плат, в которые фентанил на

5 добавляли. После часовой инкубации во влажной камере при комнатной температуре платы отмывали и в ячейки помещали 0,2 мл коньюгата ослиных антикроличьих антител с пероксидазой хрена (производство Ин0 ститута эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи) при тех же условиях инку- бирования. Через час ячейки отмывали и заполняли субстратной смесью, содержащей 8 мг о-фенилендиамина и 7 мкл 33%

5 перекиси водорода в 20 мл 0,2 М цитрат- фосфатного буфера рН 5, Через час в каждой ячейке измеряли поглощение при 490 нм. Ошибка метода, как правило, составляла не более 5-6%. Результаты выражали в про0 центах по отношению к контролю, принятому .за 100%.

На основании полученных результатов строилась калибровочная кривая определения фентакила, имеющая S-образный ха5 рактер с линейным участком в диапазоне от 10% до 90% связывания антител с твердой фазой. Согласно полученной кривой, минимально значимое изменение связывания антител к карбоксифентанилу с твердофаз0 ным гаптеном имело место при добавлении в пробу фентанила в количестве 2,510 ммоля (0,84 пг), что и определило чувствительность способа.

Предлагаемый способ обладает боль5 шей чувствительностью по сравнению с прототипом и превосходит его в 400 раз, позволяет осуществлять сотни определений одновременно в более короткие сроки (время анализа 4 ч, а для прототипа - сутки),

0 более прост в исполнении, не требует для реализации высококвалифицированного персонала и дорогостоящего, труднодоступного оборудования и реактивов, не связан с радиационной опасностью и проблемой

5 утилизации радиоактивных отходов. Формула изобретения Способ определения фентанила в водных растворах, включающий проведение иммуноанализа, о т, л имеющийся тем, что, с целью повышения чувствительности

способа, при проведении иммуноанализа используют кроличьи антитела к конюгату бычьего сывороточного альбумина и кар- боксифентанила, взаимодействующие с твердофазным тест-антигеном, при этом коньюгат с эпитопной плотностью 12 получают в реакции смешанных ангидридов, а в качестве тест-антигена используют конъю- гат гамма-глобулина лошади с карбоксифен- танилом с эпитопной плотностью 29, который получают в реакции смешанных ангидридов.