Способ биотинирования нуклеиновых кислот Советский патент 1990 года по МПК C12N15/00 

О

1-

Изобретение относится к молекулярной Oisonortnf .и .генетике и молсет Сыть использовано в других областях Оиологии и в мпдлцине для перадио- активного мечеиия нуклвнновьгх кислот

Целью изобретеинл является- упе- Jiwieiiiie гувствитедьности индикации наченпьтх биотипом ДИ.К при дот-гиСрн- .дизаюп. . ,

Б спосоОе, включающей добавление к paci Dopy нуклеиновой кислоты фото- активируемого реагента с последующим облучением раствора светом, в качест

К 2 ммоль 1,7-диаминогептана в 3 мл диокс ана добавляют «по каплям раствор 1 ммоль Н-оксисукцинимидного

пе фотоактивируемого реагента исполь- 5 эфира 4-азидо-2-нитробе1 зойной ,бифункциональное соединение,содержащее фотоактпвируемуга группу и , полож 1телЫ10 заряженную пер впчную as-tHHorpyiinyj соединенные на несущей заряда полимерной, цепочкой, и после облучения светом.обрабатывают полученное соединение б1 фуикц ональнь1м .реагентом,- содержащим активироБанный сложный эфир и бнотин, которые соединены полимерной, цепочкой.

Фотоактивируемый реагент .ддя реа- лнзадии способа - )(4-азидо-2-1гит- робензоил)1,7-диамииогептан фор- мутл ..

-co-Mi- (сн.2)7-М1г;

..

. При м е р 1. Получение фото- акт ивпр1 ;сще го реагента, 70 ммоль .. 2 нитро-4-а ;инобензойно 1 КИСЛОТ1-1 суспендируизт- в. 120 мл ,во.цы и по каплям прибавляют 40%-ный раствор едкого кал{1Я до полно го растворения кис- лотМо В получениьш -раствор вносят 60 Г К-юль нитрита натрия, л охлаждают до О С. Этот раствор по каплям при.. энергетлчном перемешивании добавляют

-к охлажденной до -2 С смеси /30. мл концентрированЕюй соляной кислоты и -150 мл Воды. Смесь оставляют па

30 мин при 0°С и затем при перемепи- вании добавляют 60 ммоль азиДа натрия, растворенного в 40 ил Бо.ш. Далее все- операции с аз -ща1-1и проводят в- затемненной комнате, Лосле 30 мин ре акции при комнатной температуре осадок отделяют, г{ерекр.исталлизоБЫ вают из воды. Выход очищенной 4-ази- до-2-иитробензойной кислоть составляет 65%. 20 ммоль 4-азидо-2-иитро. бензойной кислоты растворяют в 25 мл диоксана, прибавляют по 20 нмоль Nлрты в J мл диокСана, смесЬ выдерживают при 20° С и сильном перемешивании. -Выпавший осадок отделяют цент рифугированием, промывают дважды ди2Q океаном .и. все фракции; супернатанта объединяют. Диоксяновый рггтвор разбавляют в 5 раз аодкисленной. ьодой, появляющийся пебол1. осадо к убирают цен.тр..-ров и исм. Дополнитель25 ную очистку проводят с помощью тонкослойной хроматографии .в систеие хлороформ - этанол (8:2). Продукт, двигается одной УФ-поглощающей .зоной и не содержит примесей 4-азидо-2-

30 -нитробензойной кислоты или ее -эфира Наличие ; зидной группь подтв.ержд а ется поязленисм в ЬК-спектре характерней азидной полосы 2140 с К оольш1т плечом при 2120 см, .Спект -оглощения: Л ,,,,. 260, 370 им. При

35

ЗО

45

зи

55

ма КС

облучении светом раствора Наблюдается спойственное азидам падение поглощения в УФ- час тп спектра. .Наличие первичной аминогруппы подтверждено нинпщриновой реакцией и реакцией с Н-оксисукдинимидным зфиром биотинил- -S-аминокапроновой кислоты, в резуль тате которой получается один УФ-по- глощшощпй продукт, по подвижности отличный от исходного.

Пример 2. Реализация способа. .

Реакцшо фотолиза фотоактивируемог реагента проводят в О,1 мМ ЗДТА в присутствии ДНК в стеклянном капилляре. Облучают видимым спетом с длиной волны 340-380 нм.. Поспе экстракции избытка реагента втор-бутанолом добавляют .10-кратный избыток ( по отHomeHHJO K основаниям ПНК) Ы-,оксисук- ЦИНПМ1ЩНОГО эф.ира биотинил- -ам1п-1о- капронрвой KVic.iioTbt. выдерживают 1ч при , дваждь экстрагир тот

-оксисукциидаида н дициклогексилкар- бодннмида, Реакцночную смесь.выдерживают 20 ч при и сильном встряхивании. Выпавший оса док отфильтровывают и промывают диоксаном. Фильтрат упаривают при пониженном давле- И1ш. Полученный N-оксисукцинимидный эфир А-азидо-2-нитробензойной кислоты используют в дальнейшем без предварительной очистки.

К 2 ммоль 1,7-диаминогептана в 3 мл диокс ана добавляют «по каплям раствор 1 ммоль Н-оксисукцинимидного

эфира 4-азидо-2-нитробе1 зойной кислрты в J мл диокСана, смесЬ выдерживают при 20° С и сильном перемешивании. -Выпавший осадок отделяют центрифугированием, промывают дважды диокеаном .и. все фракции; супернатанта объединяют. Диоксяновый рггтвор разбавляют в 5 раз аодкисленной. ьодой, появляющийся пебол1. осадо к убирают цен.тр..-ров и исм. Дополнительную очистку проводят с помощью тонкослойной хроматографии .в систеие хлороформ - этанол (8:2). Продукт, двигается одной УФ-поглощающей .зоной и не содержит примесей 4-азидо-2-

-нитробензойной кислоты или ее -эфира. Наличие ; зидной группь подтв.ержд а- ется поязленисм в ЬК-спектре характерней азидной полосы 2140 с К оольш1т плечом при 2120 см, .Спектр -оглощения: Л ,,,,. 260, 370 им. При

ма КС

облучении светом раствора Наблюдается спойственное азидам падение поглощения в УФ- час тп спектра. .Наличие первичной аминогруппы подтверждено нинпщриновой реакцией и реакцией с Н-оксисукдинимидным зфиром биотинил- -S-аминокапроновой кислоты, в результате которой получается один УФ-по- глощшощпй продукт, по подвижности отличный от исходного.

Пример 2. Реализация способа. .

Реакцшо фотолиза фотоактивируемого реагента проводят в О,1 мМ ЗДТА в присутствии ДНК в стеклянном капилляре. Облучают видимым спетом с длиной волны 340-380 нм.. Поспе экстракции избытка реагента втор-бутанолом добавляют .10-кратный избыток ( по от. HomeHHJO K основаниям ПНК) Ы-,оксисук- ЦИНПМ1ЩНОГО эф.ира биотинил- -ам1п-1о- капронрвой KVic.iioTbt. выдерживают 1ч при , дваждь экстрагир тот

втор-бутанолом и ДИК осаждают 70Z- ьгм этанолом.

Биотниированную ДНК иммобнлиэупт па нитроцеллюлознызс фильтрах нагре- ваппем при в течение 2 ч. Дот- гибридизацию проводят при в среде, содержащей 50% формамида и 0,4-0,75 М NaCl в течение 3-13 ч. После обработки авидином и биотини- рованной щелочной фосфатаэой опреде- ля.емые количества ДНК обставляют значения порядка ,

При применении данного способа и синтезирова нного для его реализа- ции вещества достигнута чувстви- тельностсь, примерно на два порядка более -высокая по сравнению.с прото- типом. Положительный эффект связан с увеличением расстояния между фото активной группой и биотином.

Формула И9об ре тения

Способ биотннировакия нукленно вых кислот, .вкпючаю1цнй добавление к раотвору нухлеино.вой хислоты фотр- актияируемого реагента с последуюви1М .облучением раствора светом о т л н- ч а ю щ и ft с я тем, что, с целью повышения чувствительности индикаций меченных биотином ДНК при дотггибри- днзации, в качестве фотоактивируемо- го реагента используют Н-(4-азкдо- -2-нитробензонп) -1, Т- Диаминогептан с последующей обработкой полученного после облучения светом соединения Н-окснсукцин«мкдным эфиром биотинкй- - -аминокапроновой кислоты в количестве достаточной для блокирования всех аминогрупп.

Изобретение относится к молекулярной биологии и генетике и может быть использовано в других областях биологии и в медицине для неради.оак- тивного мечения нуклеиновых кислот. Целью изобретения является увеличение чувствительности индикации меченных биотипом ДНК при дот-гибридизации. Биотин присоединяют к нуклеиновой кислоте в две стадии. При этом на первой стадии присоединяют соединение, содержащее фотоактивируемую группу и полимерную цепочку с поло- , жительно зар.чженнон амнчогруппой на конце, а именно Н-(ч-азидо-2-нитро- беизоил) днамниогептан, а на второй - бифункциональный реагент, содержащий биотин и взаимодействующий с аминогруппой, а именно N-оксн- сукцинимидный эфир биотинил- -ами- нокапроновой кислоты. Для реализации способа синтезирован фотоакти- вируемый fiearcHT Н-(4-азндо-2-нитро- бензоил)-1,7-диаминогептан. Налнчне положительного заряда на первой стадии и его блокирование на второй обеспечивает высокий уровень кова- лентного присоединения биотина к ДНК и снижение неспецифической сорбции. Способ и синтезированный для его реализации реагент позволяют та1сже увеличить расстояние между фотоак- тивируемой группой и биотипом, что повышает чувствительность. Применение биотинированной предлагаемьм способом ДНК для гибридизации позволяет выявлять до гомологичной ДНК, причем негомологичная ДНК в количестве ТО г не выявляется. с со (Л CZ Harfb . 05