СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОТИНМЕЧЕННЫХ ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ Российский патент 1997 года по МПК C07H21/04 

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии, медицинской диагностике и может быть использовано для идентификации исследуемого биологического материала, в частности, при гибридизационном анализе нуклеиновых кислот, в том числе и вирусных, с использованием детекторной авидинбиотиновой (стрептавидин-биотиновой) системы.

Метод молекулярной гибридизации с использованием биотинмеченых олигодезоксирибонуклеотидных зондов находит широкое применение для диагностики вирусных, генетических, онкологических заболеваний.

Для сохранения биотинмеченым олигонуклеотидом способности к образованию прочного гибридизационного комплекса целесообразно вводить биотиновую метку в олигодезоксирибонуклеотид по 5¹-концевой фосфатной группе.

Известен способ получения биотинмеченых олигонуклеотидов, основанный на взаимодействии 2-(биотиниламидо) этанола с 5¹-концевой фосфатной группой защищенных олигонуклеотидов в присутствии конденсирующего агента - 1-(мезитилден-2-скльфонил)-3-нитро-1, 2,4-триазола в условиях твердофазного синтеза [1] После удаления с полимера и деблокирования были получены 3- и 5-звенные биотинмеченые олигонуклеотиды, с использованием которых наращивали цепочку олигонуклеотида до 18-20 звеньев ферментативно в присутствии ДНК-лигазы Т4.

Этот метод из-за своей сложности не получил дальнейшего развития, так как он требует сочетания различных химикоферментативных методов.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения биотинмеченых зондов, основанный на взаимодействии активированного биотина, а именно, N-оксисукцинимидного эфира биотина, с алифатической аминогруппой спейсера, предварительно введенного в олигонуклеотид [2] Присоединение биотина к олигонуклеотиду осуществляют добавлением к водному раствору олигонуклеотида N-оксисукцимидного эфира биотина, растворенного в N, N-диметилформамиде. Использование органического растворителя обусловлено низкой растворимостью в воде N-оксисукциминимидного эфира биотина. Так как олигонуклеотиды плохо растворяются в присутствии органических растворителей, реакцию ведут используя низкие концентрации олигонуклеотидов (не более 10^-4 M). При этом с увеличением длины олигонуклеотида резко уменьшается выход биотинмеченого зонда (с 90 до 50-70%), а время реакции возрастет с 1 до 20 ч соответственно.

Таким образом, использование этого способа для масштабного получения биотинмеченых олигонуклеотидных зондов исключается, что делает невозможным проведение серийных анализов вирусных инфекций.

Задачей изобретения является обеспечение возможности получения биотинмеченых олигонуклеотидов в препаративных количествах в высоким выходом целевого продукта и сокращении времени проведения процесса.

Задача достигается предлагаемым способом получения биотинмеченых олигонуклеотидов путем взаимодействия биотинсодержащего реагента с аминогруппой спейсера, предварительно введенного в олигонуклеотид, при этом в качестве биотинсодержащего реагента используют 4-сульфо-3-нитрофениловый или сульфотетрафторфениловый эфиры биотина, а процесс ведут в водном растворе. Указанные эфиры биотина получены как описано в работе [3]
Пример 1. Получение 2-нитро-4-сульфофенилового эфира биотина.

Биотин (5 ммоль) и полученную по методу, описанному в [4] натриевую соль 2-нитро-4-сульфофенола (5 ммоль) растворяют в 30 мл диметилформамида (ДМФА), охлаждают до 0^oC и вносят 5 ммоль дициклогелсилкарбодиимида (ДЦГК), выдерживают 18 ч. Затем дициклогексилмочевины удаляют фильтрованием, ДМФА отгоняют в вакууме, после чего осуществляют очистку полученного на колонке Сефадекс LH-20 (1,6 x 50 см), элюент-метанол, 2-3 мл/мин и отбирают фракции активированного эфира (контроль по ТСХ в системе: хлороформ метанол - уксусная кислота 8,6:1:0,4). Полученное соединение промерено на масс-спектрометре Perkin-Elmer/Sciex (API-III negative-ion mode). Параметры чистоты удовлетворяют требованиям, предъеявляемым к данной группе соединений. Выход продукта 80%
ИК-спектр, см^-1: 1540 (C=C), 1700 (C=O), 2860, 2940 (-CH₂-), 1230-1250 (NO-2

¹H-ЯМР, δ м.д. (ДМФА-d₇): 3,24 (m,IH, 2-CH), 4,3 (m,IH, 3-CH), 4,46 (m, IH, 4-CH), 6,34 (s, IH, 3'-NH), 6,47 (s, IH, I'-NH), 7,8-8,4 (m, 3H, цикл), 7-CH₂, 8-CH₂, 6-CH₂, 9-CH₂ группы в виде двух мультиплетов 1,57 и 1,75 с соотношением интегральных интенсивностей 4H:4H.

УФ (H₂O) a_max=215 нм (ε=18600), 250 нм (ε=6000), α_min=237 нм ε=5600
Пример 2. Получение пара-сульфотетрафторфенилового эфира биотина.

Синтез ведут аналогично описанному в примере 1, добавляя в реакционную смесь вместо натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола мононатриевую соль п-сульфотетрафторфенола, полученную из Пермского филиала Государственного института прикладной химии (НПО "Прикладная химия"). Выход продукта 73%
ИК-спектр, см^-1: 1500, 1630 (C=C), 1700 (C=O), 2860, 2940 (-CH₂-), 1240 (F-C), 620-680, 990 (SO-3

¹ЯМР, δ м.д. (ДМФА-d₇): 3,24 (m,IH, 2-CH), 4,33 (m, IH, 3-CH), 4,47 (m, IH, 4-CH), 6,34 (s, IH, 3'-NH), 6,46 (s, IH, I'-NH), 7-CH₂, 8-CH₂, 6-CH₂, 9-CH₂ группы в виде двух мультиплетов 1,59 и 1,79 с соотношением интегральных интенсивностей 4H:4H.

¹⁹F-ЯМР, d м.д. (ДМФА-d₇): -2,63 (d, 2F), 19,11 (d, 2F).

УФ (H₂O) a_max=205 нм (ε=11300), 220 нм (ε=8200) 244 нм (ε=6500) α_min=232 нм (ε=4600).
Пример 3. Получение биотенмеченого олигонуклеотида pdGACCTGCCACTTTGGTGAA.

1•10^-7 молей (20 оптических единиц при длине волны 260 нм (OF₂₆₀) 5'- фосфамида NH₂(CH₂)₃NH(CH₂)₂NH(CH₂)₃NH•pdGACCTGCCACTTTGGCGAA (олигодезоксирибонуклеотиды получены по методу [6] фосфамиды по [7]) растворяют в 50 мкл 0,1 M боратного буфера pH 9,2, добавляют 1•10^-6 молей 4-сульфо-2-нитрофенилового эфира биотина. Раствор инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч, осаждают 1 мл 2%-ного раствора LiClO₄ в ацетоне, осадок отделяют центрифугированием, промывают ацетоном, эфиром и сушат на воздухе. Осадок растворяют в 500 мкл воды, наносят на колонку (4,6 ч 250 мм) со смолой Lihrosorb RP-18 (10 мкм), хроматографируют, используя градиент концентрации ацетонитрила от 0 до 20% в 0,05 M LiClo₄. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют, упаривают. Сухой остаток растворяют в 50-100 мкл воды, добавляют к 1 мл 2% LiClo₄ в ацетоне. Осадок отделяют центрифугированием, промывают ацетоном, эфиром и сушат на воздухе. Хранят при -10^oC. Выход биотинмеченого олигонуклеотида 90%
Содержание биотина в продукте оценивают как описано в работе [5] с использованием комплекса стрептавидин-2-(4¹-гидроксифенилазо)-бензойная кислота. Стехиометрия присоединения биотина к олигонуклеотиду 1:1.

Пример 4. Получение биотинмеченого олигонуклеотида pdCACCTCTCCACCTTCATT.

Условия получения аналогичны описанным в примере 3 и отличаются тем, что используют фосфамид с аминогексиловым спейсером. Выход целевого продукта - 91% Стехиометрия присоединения биотина к олигонуклеотиду 1:1.

Пример 5. Получение биотинмеченого олигонуклеотида pdCACCTGCCACTTTGGCTGAA.

Условия получения аналогичны описанным в примере 3 и отличаются тем, что в качестве биотинсодержащего реагента используют сульфотетрафторфениловый эфир биотина. Выход целевого продукта составляет 91% Стехиометрия присоединения биотина к олигонуклеотиду 1:1.

Пример 6. Получение биотинмеченого олигонуклеотида pdGACCTGCCACTTTGGCTGAA.

Условия получения аналогичны описанным в примере 1 и отличаются тем, что используют сульфотетрафторфениловый эфир биотина и фосфамид олигонуклеотида с аминогексиловым спейсером. Выход целевого продукта 88% стехиометрия присоединения 1:1.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать препаративные количества биотинмеченых олигонуклеотидов с высоким выходом (на 20-40% выше, чем в прототипе, а время проведения процесса сократить до 1 ч.

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии, медицинской диагностики и может быть использовано для идентификации исследуемого биологического материала, в частности при гибридизационном анализе нуклеиновых кислот, в том числе вирусных, с использованием детекторной авидин-биотиновой (стрептавидин-биотиновой) системы. Предложен способ получения биотинмеченых олигонуклеотидов путем взаимодействия биотинсодержащего реагента с аминогруппой спейсера, предварительно введенного в олигонуклеотид, при этом в качестве биотинсодержащего реагента используют 4-сульфо-3-нитрофениловый или сульфотетрафторфениловый эфир биотина, а процесс ведут в водном растворе. Данный способ обеспечивает возможность получения биотинмеченых олигонуклеотидов в препаративных количествах с высоким выходом и сокращением времени проведения процесса.

Способ получения биотинмеченых олигодезоксирибонуклеотидов взаимодействием биотинсодержащего реагента с аминогруппой спейсера, предварительно введенного в олигодезоксирибонуклеотид, отличающийся тем, что в качестве биотинсодержащего реагента используют 2-нитро-4-сульфофениловый или сульфотетрафторфениловый эфир биотина, а процесс ведут в водном растворе.