Способ получения аффинного сорбента для фракционирования нуклеиновых кислот Советский патент 1991 года по МПК B01D15/08 C12N11/10 

зоил)-5-аминокапроновой кислоты в реакционной смеси 0,8 мас,%. Суспензию перемешивают при температуре 4°С в течение 18 ч, а затем промывают диметилформами- дом (1000 CMJ полученный полупродукт.

С целью восстановления нитрогрупп в нем промывают полупродукт метанолом (50 см3), добавляют 100 см3 10%-ного водного раствора дитионита Натрия и перемешивают 3 ч при 20°С. Содержание дитионита натрия 7%. Затем сорбент промывают водой (500 см3), 50%-ной уксусной кислотой (200 см3), дистиллированной водой (300 см3 , этиловым спиртом (200 см.

Формирование иммобилизованных производных актиноцина ведут непосредственно на целлюлозе путем перемешивания суспензии сорбента в 30 см этилового спирта, содержащего 0,1 г гидрохлорида N- (3-диметиламинопропил)-2-амино-3-окси-4- метилбензамида и Oi5 г парахинона в течение 24 ч при 22°С. Содержание гидрохлорида N- (3-диметиламинопропил)-2-амино-3-окси-4- метилбензамида и пара-хинона соответственно равно 0,27% и 1,3%.

Полученный сорбент отмывают этиловым спиртом (300 см и дистиллированной водой (500 см3).

В ходе получения сорбента используют азид М-(2-нитро-3-окси-4-хлорбензоил)-5- аминокапроновой кислоты, который получают по следующей методике.

Синтез азида М-(2-нитро-3-окси-4-хлор- бензоил)-5-аминокапроновой кислоты. 0,5 г М-(5-этокосикарбонилпентил)-2-нитро-3-ок- си-4-хлорбензамида растворяют в 15 см3 метилового спирта, добавляют 3 см3 гидразин-гидрата, упаривают в два приема и добавляют еще 3 см3 гидразин-гидрата. Выдерживают 12 ч при 18-20°С, защищая от прямого света, и упаривают в вакууме досуха. Остаток от упаривания растворяют в 7 см воды, а затем подкисляют уксусной кислотой до рН 6,0 и охлаждают до 5-7°С. После выдерживания в течение 10ч отфильтровывают образовавшийся осадок, промывают его водой и сушат. Выход хроматографически однородного в системах бутанол-2:3%-ный аммиак (5:2) на пластинках Силуфол UV-254 М-(5-гидразокарбонил)-2- нитро-З-окси-4-хлорбензамида с т.пл. 180- 182°С, 0,46 г (77%), т.пл. 183,5-185, 0°С (после кристаллизации из метанола). Найдено, %: N 15,80; 16,17. CisHnCIN/iOs. Вычислено, %: N 16,25. К раствору 0,69 г (2 ммоль) М-(5-гидразокарбонил-пентилУ2-нитро-3-о- кси-4-хлорбензамида в 40 см смеси уксусной и 15% соляной кислот при 0-5°С и перемешивании добавляют раствор 0,27 г (4 ммоль) нитрита натрия в 1 см воды. Перемешивание ведут 15 мин, добавляют 40 см воды и экстрагируют этилацетатом двумя порциями по 20 см3 Экстракт ввиду нестабильности продукта немедленно используют

для дериватизации аминодецил-целлюлозы. Пример 2-5. Проводили по методике примера 1. Соотношения использованных реагентов представлены в таблице.

П р и м е р 6. Хроматография ДНК, На

колонку размером 10 х 30 мм, содержащую 4 см аффинного сорбента, полученного в соответствии с примером 1, наносят 0,2 см3 раствора ДНК из молоки лосося (фирма Sigma, США) в 0,1 М натрий-фосфатном буфере рН 7,8 (содержание нативной ДНК 7,7 О.Е. или 380 мкг ДНК). Несвязавшийся материал смывают тем же буфером (50 см3). ДНК элюируют буферным раствором, содержащим. 0,5% додецилсульфата натрия,

0,5% лаурилсаркозината натрия (150 см ). Собирают фракции объемом по 4 см3. Изме- ряютУФ - поглощение каждой фракции при 260 нм. фракции, содержащее УФ-поглоща- ющий материал, объединяют и осаждают

добавлением 2,5 объемом этанола на холоде. Осадок отделяют центрифугированием, растворяют и снимают спектр поглощения в области 220-310 нм.

Промывные фракции содержат небольшое количество УФ-поглощающего материала, осаждаемого этанолом. Спектр поглощения осадка характерен для полисахаридов и представляет собой плавно спадающую от 220 к 310 нм кривую. Элюат

содержит чистую ДНК с характерным спектром ( Амакс 258 нм, E263/j;230 2,5; Е260/Е280 2,2). Выход ДНК составил-7,5 О.Е. или 98,7%.

Пример. Хроматография ДНК. На

колонку 10 х 30 мм, содержащую 4,0 см3 сорбента, полученного в соответствии с примером 2, наносят 7.6 О.Е. нативной ДНК из молоки лосося. Нанесение ДНК, промывку, регистрацию УФ-поглощения, сбор и

анализ фракций выполняют в условиях примера 6. Элюцию ДНК выполняют линейным градиентом 0,0-0,5% додецилсульфата натрия в 0,1 М катрийфосфатном буфере рН 7,8. На хроматограмме отчетливо выделяются две фракции ДНК. Фракция I (элюируется от 30 до 40% градиента, содержит 6,2 О.Е. ДНК или 81 % нанесенного материала) соответствует основной массе хромосомной ДНК из молоки лосося. Фракция II (элюируется от 50% до 70% градиента, содержит 1,3 О.Е. ДНК или 17%) соответствует ГЦ-бога- той сателлитной ДНК.

П р и м е р 8, Хроматография ДНК. В условиях примера 7 проводят разделение

препарата Д Н К (4,0 О. Е. 2бо) из молоки лосося, денатурированной нагреванием. Выход ДНК в элюенте (додецилсульфа г натрия и сэркози- лат натрия) составляет 3,8 О.Е, или 95%.

П р и м е р 9. Хроматография РНК. На колонку 10 х 30 мм, содержащую 4,0 см3 сорбента, полученного в соответствии с примером 5, наносят 2,6 О.Е. раствора дрожжевой РНК (Fluka. Швейцария). Нанесение РНК, промывку, регистрацию УФ-по- глощения, сбор и анализ фракций выполняют в условиях примера 6. Элюцию РНКвыполняютлинейным градиентом0-i M перхлората натрия в 0,1 М натрий-фосфатном буфере рН 7,8. РНК элюируется в 30- 40% градиента (0,3-0,4 М перхлората натрия). Выход РНК составляет 2,4 О.Е, или 92%.

П р и м е р 10. Хроматография ДНК. В условиях примера 9 проводят разделение препарата нативной ДНК (8,0 О.Е.) из молоки лосося. Ни в одной из фракций элюата не обнаруживается заметных количеств ДНК. В то же время ДНК количественно элюируется (выход 96%) в условиях регенерации колонки: при элюции 0,5% додеци л сульфата натрия; 0,5% саркозилата натрия в 0,1 М натрий-фосфатном буфере рН 7,8.

П р и м е р 11. Хроматография ДНК и РНК. На колонку 10 х 30 мм, содержащую 4,0 см3 сорбента, полученного в соответствии с примером 1, наносят искусственную смесь РНК (4,0 О Е.) и ДНК (7,0 О.Е.). Нанесение пробы, промывку, регистрацию УФ- поглощения, сбор и анализ фракций выполняют в условиях примера 6. Элюцию РНК и ДНК ведут ступенчатым градиентом. На первой ступени - 0,5 М перхлората натрия в 0,1 М натрий-фосфатном буфере рН 7,8 - количественно элюируется РГК (выход 95%), на второй ступени - 0,5% додецил- сульфата натрия, 0,5% саркозилата натрия в 0,1 М натрий-фосфатном буфере рН 7,8 - количественно элюируется ДНК (выход 97%).

П р и м е р 12. Хроматография ДНК. В условиях примера б проводят разделение препарата нативной ДНК (8,0 О.Е ) из молоки лосося на сорбенте, полученном в соответствии с примером 3. Ни в одной из фракций элюата не обнаружено заметных количеств ДНК. Регенерация колонки при элюции 0,5% саркозилатом натрия, 0,5%

додецилсульфатом натрия в 0,1 М натрий- фосфатном буфере рН 7,8 не позволяет де- сорбировать связавшуюся ДНК.

П р и м е р 13. Хроматография ДНК. В условиях примера 6 проводят разделение препарата нативной ДНК (8,0 О.Е.) из молоки лосося на сорбенте, полученном в соответствии с примером 4. ДНК количественно (95%, или 7,6 О.Е.) обнаруживается в проскоке с уравновешивающим буфером. То есть отсутствует связывание с сорбентом.

В условиях примеров 6-11 проводят 20 циклов фракционирования препаратов нуклеиновых кислот на колонке 10 х 30 мм с сорбентом, полученным по примерам 1,2,5. После каждого цикла колонку регенерируют, промывая последовательно 0,5% додецилсульфатом натрия, 0.5% саркозилатом натрия (20 см а затем уравновешивали 0,1 М натрий-фосфатным буферным раствором рН 7,8.

Сферическая форма микрогранулиро- ванной целлюлозы позволяет провести 20 циклов фракционирования без ухудшения гидродинамических свойств. Использованный в качестве лиганда аналог актиноцина позволяет селективно сорбировать нуклеиновые кислоты и отделять ДНК от РНК без уменьшения емкости сорбента, что не достигается на сорбенте, полученном в соответствии с прототипом.

Формула изобретения Способ получения аффинного сорбента для фракционирования нуклеиновых кислот, включающий иммобилизацию комплек- сона ДНК на поверхности полимерного носителя, отличающийся тем, что, с целью повышения селективности сорбента к нуклеиновым кислотам, в качестве полимерного носителя используют микрограну- лированную целлюлозу. , которую последовательно обрабатывают эпихлор- гидрином в концентрации 4 5-15% от массы реакционной смеси, диаминодеканом 0,06-0,035 мас.%, М-(5-азидокарбонилпен- тил)-2-нитро-3-окси-4-хлорбензамидом 0,8- 1,9 мас.%, дитионитом натрия 7-12 мас.% и пара-хиноном 1,3-3,4 мас,% в присутствии Ч-(3-диметиламинопропил)-2-амино-3-окси- -4-метилбензамида гидрохлорида в концентрации 0,27-0,51% от массы реакционной смеси.

Изобретение относится к сорбентам для аффинной хроматографии и позволяет повысить селективность разделения нуклеиновых кислот. Микрогранулированную Изобретение относится к сорбентам для аффинной хроматографии и может быть использовано для фракционирования ДНК и РНК. Цель изобретения - повышение селективности сорбента к нуклеиновым кислотам. П р и м е р 1. 100 см3 микрогранулиро- ванной целлюлозы смешивают с 100 см дистиллированной воды, добавляют 10 см 40%-ного едкого натра и 10 см3эпихлоргид- рина. Соотношения реагентов, мас.%: целлюлоза 45; едкий натр 1,8; эпихлоргидрин 4,5. Суспензию перемешивают 2 ч при 40°С, целлюлозу (100 см смешивают с 100 мл дистиллированной воды, добавляют 10 мл 40%-ного едкого натра и эпихлоргидрин в количестве 4,5-15% от массы реакционной смеси. Суспензию перемешивают 2 ч при 40°С, промывают водой и суспендируют с водным раствором диэминодекана (0,06- 0,35% от массы смеси). Перемешивают 20 ч при 35°С и промывают водой и диметилфор- мамидом, добавляют 0,8-1,9 мас.% азида М-(2-нитро-3-окси-4-хлорбензоил)-5-амино- капроновой кислоты в этилацетате с триэти- ламином и перемешивают при 4°С 18ч. Промывают диметилформамидом, метанолом и добавляют 7-12 мас.% дитионита натрия, перемешивают 3 ч при 20°С. Промывают водой, 50%-ной СНзСООН и этиловым спиртом. Добавляют пара-хинон (1,3-3,4 мас.%) и гидрохлорид ЩЗ-диметиламинопропил}- 2-амино-3-окси-4-метилбензамид (0,27-0,51 мас.%) в этиловом спирте. Перемешивают 24 ч при 22°С и промывают спиртом и водой. Сорбент используют для разделения нуклеиновых кислот. 1 табл. а затем эпоксицеллюлозу отмывают дистиллированной водой (3000 см3) и суспендируют в водном растворе 150 мг диаминодекана (концентрация диаминоде- кана 0,06%) в течение 20 ч при 35°С. После этого аминодецил-целлюлозу отмывают дистиллированной водой (4000 см ) и диметилформамидом (500 . К 10 см аминодецил-целлюлозы добавляют 10см3диметилформамида, 0,5см три- этиламинна и раствор 0,3 г азида М-(2-нитро-3-окси-4- хлорбензоил)-5-амино- капроновой кислоты в 20 см3 этилацетата. Содержание М-(2-нитро-3-окси-4-хлорбен(Л с о ел ел ел ы Јь