СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА А Российский патент 1995 года по МПК C12Q1/68 A61K39/29 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к методам определения вирусных инфекций в клинических образцах с использованием биотинированных ДНК-зондов, и может быть использовано в эпидемиологии, вирусологии, клинической медицине для выявления и идентификации вируса гепатита А (ГА).

Известны иммунологические методы детекции вируса ГА, основанные на выявлении специфических антител к вирусу ГА и его поверхностных белков: радиоиммунный и иммуноферментный анализы (соответственно РИА и ИФА) [1]
Однако тесты РИА и ИФА могут давать как ложноположительные, так и ложноотрицательные сигналы. Кроме того, эти методы детекции ГА хороши лишь на острых стадиях протекания болезни. Эффективность ранней диагностики ИФА составляет не более 30% [2]
Одним из высокоспецифичных и чувствительных методов детекции вирусов, точнее их нуклеиновых кислот (НК) является метод молекулярной гибридизации с использованием НК-зондов. В настоящее время в лабораторных исследованиях вируса ГА широко используются методы молекулярной гибридизации на основе радиоактивно-меченых ДНК-зондов. Например, известен [3] высокочувствительный метод детекции РНК вируса ГА с помощью ³²Р-меченого одноцепочечного ДНК-зонда на основе бактериофага М13 (зонд получают методом достройки второй цепи с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1). Однако применение радиоактивно-меченых ДНК-зондов в условиях клинической лаборатории, как правило, невозможно в связи с необходимостью строгого соблюдения правил радиационной безопасности, а также из-за быстрого распада радиоизотопа ³²Р (период полураспада 14 дней).

Известно использование нерадиоактивных биотин-меченых зондов на основе плазмиды pBR 322 для детекции РНК вируса ГА [4] Однако достоверно известно [5] что зонды на основе двухцепочечных ДНК уступают по чувствительности одноцепочечным.

Методы детекции РНК вируса ГА с использованием одноцепочечных биотинированных зондов в литературе не описаны.

Задачей изобретения является создание высокочувствительного способа детекции РНК вируса ГА на основе метода молекулярной гибридизации с использованием высокоспецифичного одноцепочечного биотинированного зонда, который послужит основой при создании тест-набора для широкого применения в условиях клинической практики.

Поставленная задача решается предлагаемым способом детекции РНК вируса гепатита А путем молекулярной гибридизации вирусной нуклеиновой кислоты с биотинированным ДНК-зондом, при этом в качестве зонда используют рекомбинантный бактериофаг М13 HAVP-1, содержащий вставку кДНК длиной 390 нуклеотидных звеньев, комплементарную участку генома вируса гепатита А, кодирующему оболочечный белок VP-1 и имеющую следующую нуклеотидную последовательность:
5¹ GATTCAGGAC GTTTCTCAAC AACAGTTTCT ACAGAGCAGA ATGTTCCTGA TCCCCAAGTT GGCATAAAAG GGAAAGCCAA TAGGGGAAAG ATGGATGTAT CAGGAGТGCA GGACCTGTG GGAGCTATTA CAACAATTGA GGATCCAGTT TTAGCAAAGA AAGTACCTGA GACATTTCCT GAATTGAAGC CTGGAGAATC CAGACATACA TCAGATCACA TGTCTATTTA TAAATTCATG GGAAGGTСTC ATTTCTTGTG TACTTTTACT TTTAATTCAA ACAATAAAGA GTACACATTT CCAATAACTC TGTCTTCGAC TTCTAATCCT CCTCATGGTT TACCATCAAC ATTAAGGTGG TTCTTTAATT TGTTTCAGTT GTATAGAGGA-3¹.

При конструировании зонда использована гибридная плазмида рНАv-vPI 22. В конструкции этой плазмиды по Рst 1-сайту плазмиды pBR 322 встроен фрагмент ДНК длиной 390 н.з. комплементарный РНК вируса ГА [6] Этот фрагмент выщеплен рестриктазой Pst 1 и лигирован в составе бактериофага серии М13. Полученная ДНК использована для трансформации бактерий E.col штамм IМ109. Селекция клонов проведена с использованием индикаторных чашек (с Ygal). Клоны с нарушенной экспрессией β-галактозидазы использованы для микровыделения репликативной формы ДНК. Клоны, из ДНК которых при гидролизе Pst 1 рестриктазой выщепляются фрагменты длиной 390 н.з. анализированы методом Т-скрининга. Таким способом отобраны клоны: М13НА vР1, содержащий в одноцепочечной форме фрагмент ДНК, комплементарный РНК вируса ГА, и клон М13НА vР2, содержащий тот же фрагмент, но с противоположной ориентацией. Для подтверждения структуры клонированного фрагмента ДНК обоих клонов секвенированы по методу Сенгера [7]
В экспериментах при создании клона М13 НА vР1 использован бактериофаг М13 m р9, а при конструировании аналога вирусной РНК бактериофаг М13 m р19, расщепленные по Pst 1 сайту. Клонирование в бактериофагах, наработка и выделение одноцепочечной и репликативной форм ДНК гибридных фагов осуществляются известными способами [8]
Биотинирование одноцепочечной ДНК М13НА vР1 может быть осуществлено с использованием фотоактивируемого реагента N-(4-азидо-2-нитробензоил)-1,7-диамино- гептана (лампа ХВО-150) и N-оксисукцинимидного эфира биотин- ε-аминокапроновой кислоты (Calbiochem, США) согласно известному способу [9]
Выявление биотинированного зонда может проводиться известными проявляющими системами, например с помощью конъюгата стрептавидин щелочная фосфатаза, субстрата 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата и хромогена нитроголубого тетразолия, который в процессе ферментативной реакции превращается в водонерастворимый фармазан [10]
В качестве положительных контролей в экспериментах, а также для определения чувствительности биотинированного зонда использована рекомбинантная ДНК М13 НАvP2, содержащая вставку кДНК, комплементарную вставке зонда, а также РНК вируса ГА, выделенная из суспензии очищенного вируса гепатита А (штамм НА S15), полученного из культуры клеток эмбриональной почки макаки-резус, линия FRhK-4 (институт полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН).

Фон неспецифического связывания определяют по интенсивности сигнала при гибридизации с ДНК фага λ в количестве 1 мкг, а также с суммарной РНК из образца сыворотки крови или другой биологической жидкости здорового донора.

Чувствительность предлагаемого способа достигает 10^-11 10^-12 г контрольной ДНК и 10^-10 г вируса ГА, что соответствует количеству 3 7˙ 10⁶ физических вирусных частиц [11] и соответственно такому же количеству вирусных геномов. Необходимое для анализа количество сыворотки крови (или другой биологической жидкости) 100 мкл.

П р и м е р 1. а) Выделение суммарной РНК.

Суммарную РНК из образцов сыворотки крови (мочи, слюны или другой биологической жидкости) выделяют методом фенольной экстракции с предварительной обработкой образцов протеиназой К в присутствии лаурилсульфата натрия [12]
100 мкл сыворотки крови (СК) смешивают со 100 мкл раствора протеиназы К (Sigma, 400 мкг/мл) в буфере 0,2 М трис-HCl рН 7,5 25 мМ ЕДТА 0,3 М NaCl 2% (мас. /об. ) лаурилсульфата натрия и инкубируют при 37^оС в течение 30 мин. К полученному объему добавляют равный объем фенола, смесь инкубируют при 42^оС в течение 6 мин, энергично встряхивая. Далее ведут вымораживание в течение 20 мин при -20^оС и центрифугируют 10 мин при 0^оС и 10000 об./мин.

Водную фазу (300 мкл) переносят в новую пробирку, добавляют равный объем хлороформа, встряхивают и центрифугируют 3 мин при 10000 об./мин. Водную фазу (250 мкл), содержащую суммарную РНК, переносят в новую пробирку, смешивают с 3 объемами 10хSSC 6,2 М формальдегида и хранят при -70^оС (1хSSC представляет собой 0,15 М NaCl 0,015 М цитрат натрия).

б) Иммобилизация суммарной РНК на нитроцеллюлозном фильтре.

Экстракт нагревают в течение 15 мин при 65^оС и наносят на нитроцеллюлозный фильтр (НЦ) (Hy bond, Amersham, Великобритания), уравновешенный 10х SSC, с помощью аппарата типа "Minifold" при умеренном вакууме. НЦ сушат на воздухе, а затем в вакуумном сушильном шкафу при 80^оС в течение 2 ч.

в) Реакция дот-гибридизации.

Предгибридизацию ведут в буфере, содержащем 50% формамида, 5х раствор Денхардта без альбумина (однократный раствор Денхардта представляет собой смесь 0,02% фиколла, 0,02% поливинилпирролидона и 0,02% БСА), 0,75 М NaCl, 0,05 М Na-фосфат, рН 7,2, в течение 2 ч при 42^оС [13] Гибридизацию ведут в тех же условиях в течение 16-20 ч. Концентрация зонда 150 мг/мл. Отмывку НЦ фильтра проводят в стандартных условиях [13]
г) Выделение сгибридизовавшегося биотинированного зонда.

Визуализацию зонда осуществляют с помощью стандартной проявляющей системы: конъюгат стрептавидин щелочная фосфатаза (Ст-ЩФ) (Calbiochem) с субстратами 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата Na-соль (BCIP) и нитротетразолиевый синий (ПВТ) фирмы Sigma по методике [10]
Результаты гибридизации оценивают визуально путем сравнения с интенсивностью окраски контрольных проб.

На фиг.1 представлены результаты гибридизации предлагаемого биотинированного зонда (биозонд):
с контрольной ДНК (а);
с РНК из суспензии очищенного вируса ГА (б);
с образцами сыворотки крови от больных (62 пробы) и контактировавших с больными лиц (8 проб, обведены в рамку) из очага вспышки ГА (в).

Как видно на фиг.1, чувствительность биозонда достигает 1 пг контрольной ДНК (а), 100 пг вируса ГА (б). По крайней мере, 22 пробы больных и 4 пробы от контактных лиц положительные на присутствие РНК вируса ГА (в). К₁ ДНК фага в количестве 1 мкг; К₂ ДНК из 1 нг очищенного препарата вируса ГА; К₃ суммарная РНК из образца сыворотки крови здорового донора.

д) Проверка предлагаемого способа детекции вируса ГА.

Исследованные образцы сыворотки крови из очага вспышки ГА были параллельно тестированы в ИФА на наличие IgM к вирусу ГА с помощью тест-набора СП "ДИАплюс" (г. Москва). 43 пробы из 62 (от больных) оказались положительными в ИФА ( ≈70%), из них 16 (37,2%) положительные также в реакции с предлагаемым биотинированным зондом, что соответствует литературным данным [14] о приблизительно 30%-ном вирусоносительстве среди больных ГА.

Из 70 образцов, подвергнутых анализу, были отобраны 20 проб (на фиг.1в и 2 обозначены цифрами) для поиска РНК вируса ГА с помощью метода амплификации (15, 16). Из 20 результатов совпали 17 (85%), в том числе оказались положительными в обоих случаях 3 пробы от контактировавших (дорожки 11-13) с больными (дорожки 1-10, 14-20) лиц, давшие отрицательные результаты в ИФА.

Из четырех контактировавших с больными лиц, чьи СК были положительны на наличие РНК вируса ГА, двое впоследствии заболели ГА в явной форме, что также соответствует литературным данным о частом бессимптомном и безжелтушном течении ГА [1, 14, 17]
Результаты анализа продуктов полимеразной цепной реакции приведены на фиг. 2. В качестве контроля (К₄) использован амплифицированный фрагмент плазмидной ДНК со встроенным участком генома белка vP1 вируса ГА, полученный с использованием 2 праймеров. Праймеры, комплементарные наиболее консервативным участкам гена белка vP1 вируса ГА, применялись также при анализе проб.

Были также поставлены опыты с СКА здоровых людей (доноров из пункта переливания крови). Для этого 30 образцов СК были тестированы предлагаемым способом и в реакции амплификации. Результаты анализов оказались отрицательными.

Источники информации:
1. Жданов В.М. Ананьев В.А. и Стаханова В.М. Вирусные гепатиты, М. 1986, с. 41.

2. Донец М.А. и др. Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 1988, N 1, с. 61-65.

3. Николаева Е.С. и др. Вопросы вирусологии, 1990, N 5, с. 385-386.

4. Enzo Diagnostics, inc (an Enzo Biochem Company). Product Catalog, 1988, с. 28.

5. Hu N-T, Messing g. Gene, 1982, 17, р.271-277.

6. Овчинников Ю. А. и др. Доклады АН СССР, 1985, т. 285, N 4, с.1014-1018.

7. F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Conlson, Proc. Natl Acad. Sci USA, 1977, 74, р. 5463-5467.

8. Anonyms, M13 Clining 1 "Dideoxy" Sequencing Manual Gaithersburg, 1980.

9. Вейко Н.Н. и др. Биотехнология, 1989, т. 5, N 4, с. 414-419.

10. G.G. Leary, D.G. Brigati, D.C. Ward, Proc. Natl Acad. Sci USA, 1983, 80 N 13, р.4045-4049.

11. R. Rueckert. On the structure and morphogenesis of Picornaviruses in: Comprehensive Virology (Fraenkel-Conrat Hand Wagner R eds). New Jork: Plenum, 1976, 6, р.131-213.

12. G.R. Ticehurst, S.M. Feinstone, J. Chestnut et al. G. Clin Microbiol, 1987, 25, N 10, р. 1822-1829.

13. Nucleic Acid Hybridization: a Practical Approach /Eds B.D. Hames, S. G. Higgins-Oxford Washington: JRL Press, 1985.

14. A.G. Coulepis, B.N. Anderson and J.D. Gust. Advanc in Virus Research, 1987,32, р.129-169.

15. Saiki R.K. Gerfand D.H/ Stoffel S et al. Science, 1988,239, р.487-491.

16. P. J. Doherty, M. Huesca Contveras, Docch H.M. Pan S, Anal Biochem. 1989,177, р. 7-10.

17. Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты. Л. Медицина, 1987.

Использование: биотехнология, а именно методы определения вирусных инфекций в клинических образцах, эпидемиология, вирусология, клиническая медицина для выявления и идентификации вируса гепатита А. Сущность изобретения: способ детекции рибонуклеиново-кислотного вируса гепатита А путем молекулярной гибридизации вирусной нуклеиновой кислоты с биотинированным дезоксинуклеиновокислотным зондом, при этом в качестве зонда используют рекомбинантный бактериофа М13 HAVP-1, содержащий вставку к дезоксинуклеиновым кислотам длиной 390 нуклеотидных звеньев, комплементарную участку генома вируса гепатита А, кодирующему оболочечный белок VP-1 и имеющую следующую нуклеотидную последовательность: 5'-CATTCAGGAG GTTTCTCAAC AACAGTTTCT ACAGAGCAGA ATGTTCCTGA TCCCCAAGTT GGCATAAAAG GGAAAGCCAA TAGGGGAAAG ATGGATGTAT CAGGACTGCA GGCACCTGTG GGAGCTATTA CAACAATTGA GGATCCAGTT TTAGCAAAGA AAGTACCTGA GACATTTCCT GAATTGAAGC CTGGACAATC CAGACATACA TCAGATCACA TGTCTATTTA TAAATTCATG GAAAGGTCTC ATTTCTTGTG TACTTTTACT TTTAATTCAA ACAATAAAGA GTACACATTT CCAATAACTC TGTCTTCGAC TTCTAATCCT CCTCATGGTT TACCATCAAC ATTAAGGTGG TTCTTTAATT TGTTTCAGTT GTATAGAGGA-3'. 2 ил.

СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА А путем молекулярной гибридизации вирусной нуклеиновой кислоты с биотинированным ДНК-зондом, отличающийся тем, что в качестве зонда используют рекомбинантный бактериофаг М13 HAVP-1, содержащий вставку к ДНК длиной 390 нуклеотидных звеньев, комплементарную участку генома вируса гепатита А, кодирующему оболочечный белок VP-1, и имеющую следующую нуклеотидную последовательность:
5¹ GATTCAGGAG GTTTCTCAAC AACAGTTTCT ACAGAGCAGA ATGTTCCIGA TCCCCAAGTT GGCATAAAAG GGAAAGCCAA TAGGGGAAAG ATGGATGTAT CAGGAGTGCA GGCACCTGTG GGAGCTATTA CAACAATTGA GGATCCAGTT TTAGCAAAGA AAGTACCTGA GACATTTCCT GAATTGAAGC CTGGAGAATC CAGACATACA TCAGATCACA TGTCTATTTA TAAATTCATG GGAAGGTCTC ATTTCTTGTG TACTTTTACT TTTAATTCAA ACAATAAAGA GTACACATTT CCAATAACTC TGTCTTCGAC TTCTAATCCT CCTCATGGTT TACCATCAAC ATTAAGGTGG TTCTTTAATT TGTTTCAGTT GTATAGAGGA 3¹.