4-АЗИДОНАФТАЛИН-1-СУЛЬФОНИЛХЛОРИД КАК ПОЛУПРОДУКТ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРИЛИТИЕВОЙ СОЛИ (1`R,5`R)-3` -АЗА-1`-(2-АМИНО -1,6-ДИГИДРО -6-ОКСОПУРИНИЛ-9) -3`-ДЕЗОКСИ -3`-(4-АЗИДОНАФТАЛИН -1-СУЛЬФАМИДО) ГЕКСОПИРАНОЗИЛ -6`-ТРИФОСФАТА - СПЕЦИФИЧЕСКОГО ФОТОАКТИВИРУЕМОГО НЕОБРАТИМОГО ИНГИБИТОРА РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ Российский патент 1995 года по МПК C07C309/88 C12N9/99 

Изобретение относится к новому химическому соединению 4-азидонафталин-1-сульфонилхлориду формулы I
как полупродукту для получения трилитиевой соли (1'R, 5'R)-3'-аза-1'-(2-мино-1,6-дигидро-6-оксопуринил-9)-3'- дезокси-3'-(4-азидонафталин-1-сульфамидо)гексопиранозил-6'- трифосфата формулы II
HO которая является специфическим фотоактивируемым необратимым ингибитором РНК-полимеразы и может быть использована в биохимии, биофизике и молекулярной биологии для изучения строения и механизма действия РНК-полимеразы.

Известен 5-азидонафталин-1-сульфонилхлорид в качестве полупродукта для получения фотоактивируемых необратимых модификаторов белков /1/.

Данное соединение не использовалось как полупродукт для создания специфического фотоактивируемого необратимого ингибитора РНК-полимеразы.

Наиболее близким к описываемому является известное соединение -4-(фторсульфонил)бензоилхлорид, который применялся как полупродукт для получения 5'-/4-(фтоpсульфонил)бензоил/гуанозина, оказывающего специфическое необратимое действие на РНК-полимеразу /2/.

Однако указанный известный полупродукт обладает следующими недостатками:
недостаточно высокой эффективностью ингибирующего действия модификатора, полученного на его основе;
отсутствием в составе молекулы вышеуказанного модификатора флуорофорного фрагмента, что существенно ограничивает область его применения;
плохой растворимостью вышеуказанного модификатора в водной среде.

Цель изобpетения создание нового соединения в ряду производных аренсульфонилгалогенида, которое позволяет получить новый, более эффективный специфический необратимый ингибитор РНК-полимеразы на основе производного 5'-гуаниловых нуклеотидов.

Цель достигается 4-азидонафталин-1-сульфонилхлоридом (1) указанной формулы как полупродуктом для получения трилитиевой соли (1'R, 5'R)-3'-аза-1'-(2-амино-1,6-дигидро-6-оксопуринил-9)-3'-дезоси-3'-(4-азидона фталин-1-сульфамидо)гексо- пиранозил-6' -трифосфата специфического фотоактивируемого необратимого ингибитора РНК-полимеразы.

4-Азидонафталин-1-сульфонилхлорид получают способом, основанным на известной реакции хлордегидроксилирования азидонафталин-1-сульфокислот пятихлористым фосфором [1]
Исходную 4-азидонафталин-1-сульфокислоту получают замещением диазогруппы азидной у диазониевого производного соответствующей аминонафталин-1-сульфокислоты при взаимодействии с азидом натрия [1]
Соединение II получают способом, основанным на следующих известных реакциях:
гидразинолизе аренсульфонилхлоридов избытком гидразина [3]
циклизации продуктов периодатного окисления рибонуклеотидов с гидразидами аренсульфокислот в водноорганической среде при рН 4,5-5,0 [2]
П р и м е р 1. 4-Азидонафталин-1-сульфохлорид (1).

2,1 г (8,5 ммоль) 4-азидонафталин-1-сульфокислоты при красном свете смешивают с 4,4 г (21 ммоль) пятихлористого фосфора и выдерживают при 60-80^оС в течение 1 ч. После этого образовавшийся расплав переносят в ледяную воду и выделившийся целевой продукт экстрагируют толуолом. Объединенные экстракты промывают охлажденным 2% -ным раствором бикарбоната натрия, затем холодной водой, высушивают над безводным сульфатом магния и упаривают при пониженном давлении. Остаток растирают с 50 мл гексана и оставляют на 15 ч при -20^оС. Полученный продукт повторно перекристаллизовывают из смеси толуол-гексан. Получают 0,89 г целевого продукта (выход 39%). Т.пл. 114-116^оС (с разл.).

Вычислено, С 44,87; Н 2,26; Сl 13,24.

С₁₀Н₆СlN₃О₂S
Найдено, С 45,29; Н 2,38; Сl 12,97.

Соединение охарактеризовано хроматографической подвижностью при тонкослойной хроматографии на пластинках "Silufol" в гексане, Rf 0,34.

ИК-спектр (КВr), ν, cм^-1: 1160, 1340 (SO₂Сl), 2095 (N₃).

П р и м е р 2. 4-Азидонафталин-1-сульфонилгидразин.

Раствор 0,4 г (1,5 ммоль) 4-азидонафталин-1-сульфонилхлорида в 10 мл безводного диоксана при красном свете прибавляют по каплям к интенсивно перемешиваемому раствору 0,4 г (0,4 мл, 8 ммоль) гидразин-гидрата в 10 мл безводного диоксана при охлаждении реакционной смеси на водяной бане. После этого реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение получаса, отделяют органическую фазу, упаривают ее при пониженном давлении и температуре не выше 30^оС до объема ≈1 мл и добавляют 5 мл охлажденного этанола. Выпавший осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из смеси диоксан-этанол. Получают 0,33 г целевого продукта (выход 82%).

Т.пл. 147-148^оС (с разл.).

Вычислено, С 45,62; Н 3,45; N 26,60.

С₁₀Н₉N₅O₂S
Найдено, С 48,83; Н 3,29; N 26,74.

Соединение охарактеризовано хроматографической подвижностью при тонкослойной хроматографии на пластинках "Silufol" в системах:
А) н-бутанол-вода (85:15, об.) Rf 0,88.

Б) бензол-этилацетат (1:1, об.) Rf 0,60.

ИК-спектр (КВr), ν, cм^-1: 1020, 1270 (SO₂NH), 2100 (N₃), 3240 (NH₂).

П р и м е р 3. Трилитиевая соль (1'R, 5'R)-3'-аза-1'-(2-амино-1,б-дигидро-6-оксо-пуринил-9)-3'-дезокси-3'-(4-азидо нафталин-1 -сульфамидо)гексопиранозил-6'-трифосфата (II).

К раствору 64 мг (0,1 ммоль) натриевой соли оксо-гуанозин-5' -трифосфата, очищенной от примеси иодата натрия, в 5 мл 1 М литийацетатного буфера (рН 5,0) при перемешивании и красном свете добавляют раствор 34 мг (0,13 ммоль) 4-азидонафталин-1-сульфонилгидразина в 7 мл диоксана. Полученный раствор перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре, защищая от света, затем упаривают при пониженном давлении до объема ≈ 0,5 мл и обрабатывают 5 мл охлажденной смеси безводный этанол безводный диэтиловый эфир (3: 1, об. ). Выпавший осадок отделяют центрифугированием, промывают безводным диоксаном, затем безводным диэтиловым эфиром и высушивают в вакууме в присутствии фосфорного ангидрида. Получают 50 мг целевого продукта (выход 63,5%).

Вычислено, С 28,67; Н 2,89; Р 14,78.

С₂₀Н₂₀Li₃N₁₀O₁₆P₃S ˙2H₂O
Найдено, С 28,96; Н 2,97; Р 14,51.

Соединение охарактеризовано хроматографической подвижностью при тонкослойной хроматографии на пластинках "Silufol" в системах:
В) н-бутанол уксусная кислота вода (5:2:3, об.) Rf 0,34.

Г) изомасляная кислота конц. раствор аммиака вода (66:1:33) Rf=0,36.

УФ-спектр, λ ^pH7_max нм (ε М^-1˙ см^-1):
237 (18 200), 273 пл. (3 600), 320 (3 400).

Изучение ингибирования РНК-полимеразы соединением II, полученным на основе описываемого 4-азидонафталин-1-сульфонилхлорида (I), проводили следующим образом.

ДНК-зависимую РНК-полимеразу фага Т7 выделяли из штамма-продуцента E. coli. Активность фермента определяли по образованию /³²Р/-РНК из /³²Р/-нуклеозидтрифосфатов.

Инкубационная смесь для определения активности содержит 50 мМ Трис-НСl, рН 7,8; 10 мМ MgCl₂; 5 мМ LiCl; 10 мМ β-меркаптоэтанол, раствор плазмиды рGEM-2 ("Promega Biochem.", США) 20-40 мкг/мл; аденозин-5'-трифосфат (АТФ), уридин-5'-трифосфат (УТФ), цитидин-5'-трифосфат (ЦТФ) и гуанозин-5'-трифосфат (ГТФ) по 0,4 мкмоль/мл; / α-³²Р/-АТФ или / α-³²Р/-УТФ (200 000 имп. /мин на пробу); фермент 0,2-0,5 мкг в пробе. При определении ингибирующего действия в среду инкубации при красном свете вносят изучаемое соединение для получения раствора требуемой концентрации. Общий объем пробы 25 мкл. Реакцию проводят при 37^оС в течение 20 мин. Определение количества образовавшейся РНК (кислотонерастворимого материала) проводят известным способом.

Значение I₅₀ определяют из графика зависимости активности фермента от концентрации ингибитора.

Используемый препарат ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7 имеет активность 130000 160000 ед. и характеризуется следующими значениями Км для нуклеозид-5' -трифосфатов: К_мГТФ 0,16 мМ; К_мАТФ 0,04 мМ; К_мЦТФ 0,08 мМ; К_мУТФ 0,06 мМ. Инициирующим реакцию нуклеозидтрифосфатом является ГТФ.

В указанных условиях (при красном свете) значение I₅₀ для соединения II составило 0,35 мМ. Ингибирование носило обратимый характер.

Под действием света (λ 320 ±10 нм) происходит необратимое связывание ингибитора ll с ферментом в результате генерации высокореакционноспособного нитренового радикала. Свободнорадикальный механизм реакции делает возможным ковалентное взаимодействие ингибитора практически с любыми аминокислотными остатками в связывающем участке белка.

Эффект ингибирования РНК-полимеразы соединением II в условиях фотолиза увеличивается с течением времени и не уменьшается после его удаления из среды преинкубации (гель-фильтрация), что указывает на необратимое связывание ингибитора с ферментом. Препарат фермента, модифицированного соединением II, после гель-фильтрации обладал выраженными флуоресцентными свойствами ( λ _maxвозб.350 нм, λ _{mахфлуор}. 425 нм), что также свидетельствует о необратимом связывании ингибитора II с РНК-полимеразой.

При совместной преинкубации РНК-полимеразы с соединением II с 5 мМ ГТФ (субстрат РНК-полимеразы) наблюдается защитный эффект от действия ингибитора, что указывает на его специфическое взаимодействие с активным центром фермента.

Ингибирование РНК-полимеразы соединением II (в условиях фотолиза), а также наиболее близким структурным аналогом -5'-/4-(фторсульфонил)бензоил/гуанозином (III), охарактеризовано данными, приведенными в таблице.

При изучении изменения интенсивности флуоресценции ковалентного фермент-ингибиторного комплекса в результате осуществленного щелочного гидролиза (рН 12, 0^оС, 48 ч) морфолинового фрагмента остатка ингибитора II было обнаружено увеличение интенсивности флуоресценции ≈ в 1,5 раза.

Как вытекает из сравнения указанных данных соединение II оказывает значительно более выраженное ингибирующее действие на РНК-полимеразу по сравнению с известным соединением III и расширяет арсенал специфических необратимых ингибиторов фермента, что позволяет более эффективно проводить его изучение с помощью спектрофлуориметрии. Таким образом, описываемый 4-азидонафталин-1-сульфонилхлорид позволяет сравнительно простым способом получить новый фотоактивируемый модификатор для локализации ГТФ-связывающих центров в белках.

Использование: в качестве полупродукта для получения специфического фотоактивируемого необратимого ингибитора РНК-полимеразы. Сущность: продукт 4-азидонафталин-1-сульфонилхлорид. Выход 39% , т. пл. 114 - 116°С, БФ C₁₀H₆ClN₃O₂S. Реагент 1: 4-азидонафталин-1-сульфокислота. Реагент 2: пятихлористый фосфор. Условия реакции: 60 - 80°С. 1 табл.

4-Азидонафталин-1-сульфонилхлорид формулы

как полупродукт для получения трилитиевой соли (1'R,5'R) -3'-аза-1'-(2-амино-1,6- дигидро-6-оксопуринил-9) -3'-дезокси-3'- (4-азидонафталин -1-сульфамидо) гексапиранозил-6'-трифосфата специфического фотоактивируемого необратимого ингибитора РНК-полимеразы.