4-АЗИДОНАФТАЛИН-1-СУЛЬФОНИЛХЛОРИД КАК ПОЛУПРОДУКТ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРИЛИТИЕВОЙ СОЛИ (1`R,5`R)-3` -АЗА-1`-(2-АМИНО -1,6-ДИГИДРО -6-ОКСОПУРИНИЛ-9) -3`-ДЕЗОКСИ -3`-(4-АЗИДОНАФТАЛИН -1-СУЛЬФАМИДО) ГЕКСОПИРАНОЗИЛ -6`-ТРИФОСФАТА - СПЕЦИФИЧЕСКОГО ФОТОАКТИВИРУЕМОГО НЕОБРАТИМОГО ИНГИБИТОРА РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ Российский патент 1995 года по МПК C07C309/88 C12N9/99 

Описание патента на изобретение RU2036902C1

Изобретение относится к новому химическому соединению 4-азидонафталин-1-сульфонилхлориду формулы I
как полупродукту для получения трилитиевой соли (1'R, 5'R)-3'-аза-1'-(2-мино-1,6-дигидро-6-оксопуринил-9)-3'- дезокси-3'-(4-азидонафталин-1-сульфамидо)гексопиранозил-6'- трифосфата формулы II
HO которая является специфическим фотоактивируемым необратимым ингибитором РНК-полимеразы и может быть использована в биохимии, биофизике и молекулярной биологии для изучения строения и механизма действия РНК-полимеразы.

Известен 5-азидонафталин-1-сульфонилхлорид в качестве полупродукта для получения фотоактивируемых необратимых модификаторов белков /1/.

Данное соединение не использовалось как полупродукт для создания специфического фотоактивируемого необратимого ингибитора РНК-полимеразы.

Наиболее близким к описываемому является известное соединение -4-(фторсульфонил)бензоилхлорид, который применялся как полупродукт для получения 5'-/4-(фтоpсульфонил)бензоил/гуанозина, оказывающего специфическое необратимое действие на РНК-полимеразу /2/.

Однако указанный известный полупродукт обладает следующими недостатками:
недостаточно высокой эффективностью ингибирующего действия модификатора, полученного на его основе;
отсутствием в составе молекулы вышеуказанного модификатора флуорофорного фрагмента, что существенно ограничивает область его применения;
плохой растворимостью вышеуказанного модификатора в водной среде.

Цель изобpетения создание нового соединения в ряду производных аренсульфонилгалогенида, которое позволяет получить новый, более эффективный специфический необратимый ингибитор РНК-полимеразы на основе производного 5'-гуаниловых нуклеотидов.

Цель достигается 4-азидонафталин-1-сульфонилхлоридом (1) указанной формулы как полупродуктом для получения трилитиевой соли (1'R, 5'R)-3'-аза-1'-(2-амино-1,6-дигидро-6-оксопуринил-9)-3'-дезоси-3'-(4-азидона фталин-1-сульфамидо)гексо- пиранозил-6' -трифосфата специфического фотоактивируемого необратимого ингибитора РНК-полимеразы.

4-Азидонафталин-1-сульфонилхлорид получают способом, основанным на известной реакции хлордегидроксилирования азидонафталин-1-сульфокислот пятихлористым фосфором [1]
Исходную 4-азидонафталин-1-сульфокислоту получают замещением диазогруппы азидной у диазониевого производного соответствующей аминонафталин-1-сульфокислоты при взаимодействии с азидом натрия [1]
Соединение II получают способом, основанным на следующих известных реакциях:
гидразинолизе аренсульфонилхлоридов избытком гидразина [3]
циклизации продуктов периодатного окисления рибонуклеотидов с гидразидами аренсульфокислот в водноорганической среде при рН 4,5-5,0 [2]
П р и м е р 1. 4-Азидонафталин-1-сульфохлорид (1).

2,1 г (8,5 ммоль) 4-азидонафталин-1-сульфокислоты при красном свете смешивают с 4,4 г (21 ммоль) пятихлористого фосфора и выдерживают при 60-80оС в течение 1 ч. После этого образовавшийся расплав переносят в ледяную воду и выделившийся целевой продукт экстрагируют толуолом. Объединенные экстракты промывают охлажденным 2% -ным раствором бикарбоната натрия, затем холодной водой, высушивают над безводным сульфатом магния и упаривают при пониженном давлении. Остаток растирают с 50 мл гексана и оставляют на 15 ч при -20оС. Полученный продукт повторно перекристаллизовывают из смеси толуол-гексан. Получают 0,89 г целевого продукта (выход 39%). Т.пл. 114-116оС (с разл.).

Вычислено, С 44,87; Н 2,26; Сl 13,24.

С10Н6СlN3О2S
Найдено, С 45,29; Н 2,38; Сl 12,97.

Соединение охарактеризовано хроматографической подвижностью при тонкослойной хроматографии на пластинках "Silufol" в гексане, Rf 0,34.

ИК-спектр (КВr), ν, cм-1: 1160, 1340 (SO2Сl), 2095 (N3).

П р и м е р 2. 4-Азидонафталин-1-сульфонилгидразин.

Раствор 0,4 г (1,5 ммоль) 4-азидонафталин-1-сульфонилхлорида в 10 мл безводного диоксана при красном свете прибавляют по каплям к интенсивно перемешиваемому раствору 0,4 г (0,4 мл, 8 ммоль) гидразин-гидрата в 10 мл безводного диоксана при охлаждении реакционной смеси на водяной бане. После этого реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение получаса, отделяют органическую фазу, упаривают ее при пониженном давлении и температуре не выше 30оС до объема ≈1 мл и добавляют 5 мл охлажденного этанола. Выпавший осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из смеси диоксан-этанол. Получают 0,33 г целевого продукта (выход 82%).

Т.пл. 147-148оС (с разл.).

Вычислено, С 45,62; Н 3,45; N 26,60.

С10Н9N5O2S
Найдено, С 48,83; Н 3,29; N 26,74.

Соединение охарактеризовано хроматографической подвижностью при тонкослойной хроматографии на пластинках "Silufol" в системах:
А) н-бутанол-вода (85:15, об.) Rf 0,88.

Б) бензол-этилацетат (1:1, об.) Rf 0,60.

ИК-спектр (КВr), ν, cм-1: 1020, 1270 (SO2NH), 2100 (N3), 3240 (NH2).

П р и м е р 3. Трилитиевая соль (1'R, 5'R)-3'-аза-1'-(2-амино-1,б-дигидро-6-оксо-пуринил-9)-3'-дезокси-3'-(4-азидо нафталин-1 -сульфамидо)гексопиранозил-6'-трифосфата (II).

К раствору 64 мг (0,1 ммоль) натриевой соли оксо-гуанозин-5' -трифосфата, очищенной от примеси иодата натрия, в 5 мл 1 М литийацетатного буфера (рН 5,0) при перемешивании и красном свете добавляют раствор 34 мг (0,13 ммоль) 4-азидонафталин-1-сульфонилгидразина в 7 мл диоксана. Полученный раствор перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре, защищая от света, затем упаривают при пониженном давлении до объема ≈ 0,5 мл и обрабатывают 5 мл охлажденной смеси безводный этанол безводный диэтиловый эфир (3: 1, об. ). Выпавший осадок отделяют центрифугированием, промывают безводным диоксаном, затем безводным диэтиловым эфиром и высушивают в вакууме в присутствии фосфорного ангидрида. Получают 50 мг целевого продукта (выход 63,5%).

Вычислено, С 28,67; Н 2,89; Р 14,78.

С20Н20Li3N10O16P3S ˙2H2O
Найдено, С 28,96; Н 2,97; Р 14,51.

Соединение охарактеризовано хроматографической подвижностью при тонкослойной хроматографии на пластинках "Silufol" в системах:
В) н-бутанол уксусная кислота вода (5:2:3, об.) Rf 0,34.

Г) изомасляная кислота конц. раствор аммиака вода (66:1:33) Rf=0,36.

УФ-спектр, λ pH7max нм (ε М-1˙ см-1):
237 (18 200), 273 пл. (3 600), 320 (3 400).

Изучение ингибирования РНК-полимеразы соединением II, полученным на основе описываемого 4-азидонафталин-1-сульфонилхлорида (I), проводили следующим образом.

ДНК-зависимую РНК-полимеразу фага Т7 выделяли из штамма-продуцента E. coli. Активность фермента определяли по образованию /32Р/-РНК из /32Р/-нуклеозидтрифосфатов.

Инкубационная смесь для определения активности содержит 50 мМ Трис-НСl, рН 7,8; 10 мМ MgCl2; 5 мМ LiCl; 10 мМ β-меркаптоэтанол, раствор плазмиды рGEM-2 ("Promega Biochem.", США) 20-40 мкг/мл; аденозин-5'-трифосфат (АТФ), уридин-5'-трифосфат (УТФ), цитидин-5'-трифосфат (ЦТФ) и гуанозин-5'-трифосфат (ГТФ) по 0,4 мкмоль/мл; / α-32Р/-АТФ или / α-32Р/-УТФ (200 000 имп. /мин на пробу); фермент 0,2-0,5 мкг в пробе. При определении ингибирующего действия в среду инкубации при красном свете вносят изучаемое соединение для получения раствора требуемой концентрации. Общий объем пробы 25 мкл. Реакцию проводят при 37оС в течение 20 мин. Определение количества образовавшейся РНК (кислотонерастворимого материала) проводят известным способом.

Значение I50 определяют из графика зависимости активности фермента от концентрации ингибитора.

Используемый препарат ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7 имеет активность 130000 160000 ед. и характеризуется следующими значениями Км для нуклеозид-5' -трифосфатов: КмГТФ 0,16 мМ; КмАТФ 0,04 мМ; КмЦТФ 0,08 мМ; КмУТФ 0,06 мМ. Инициирующим реакцию нуклеозидтрифосфатом является ГТФ.

В указанных условиях (при красном свете) значение I50 для соединения II составило 0,35 мМ. Ингибирование носило обратимый характер.

Под действием света (λ 320 ±10 нм) происходит необратимое связывание ингибитора ll с ферментом в результате генерации высокореакционноспособного нитренового радикала. Свободнорадикальный механизм реакции делает возможным ковалентное взаимодействие ингибитора практически с любыми аминокислотными остатками в связывающем участке белка.

Эффект ингибирования РНК-полимеразы соединением II в условиях фотолиза увеличивается с течением времени и не уменьшается после его удаления из среды преинкубации (гель-фильтрация), что указывает на необратимое связывание ингибитора с ферментом. Препарат фермента, модифицированного соединением II, после гель-фильтрации обладал выраженными флуоресцентными свойствами ( λ maxвозб.350 нм, λ mахфлуор. 425 нм), что также свидетельствует о необратимом связывании ингибитора II с РНК-полимеразой.

При совместной преинкубации РНК-полимеразы с соединением II с 5 мМ ГТФ (субстрат РНК-полимеразы) наблюдается защитный эффект от действия ингибитора, что указывает на его специфическое взаимодействие с активным центром фермента.

Ингибирование РНК-полимеразы соединением II (в условиях фотолиза), а также наиболее близким структурным аналогом -5'-/4-(фторсульфонил)бензоил/гуанозином (III), охарактеризовано данными, приведенными в таблице.

При изучении изменения интенсивности флуоресценции ковалентного фермент-ингибиторного комплекса в результате осуществленного щелочного гидролиза (рН 12, 0оС, 48 ч) морфолинового фрагмента остатка ингибитора II было обнаружено увеличение интенсивности флуоресценции ≈ в 1,5 раза.

Как вытекает из сравнения указанных данных соединение II оказывает значительно более выраженное ингибирующее действие на РНК-полимеразу по сравнению с известным соединением III и расширяет арсенал специфических необратимых ингибиторов фермента, что позволяет более эффективно проводить его изучение с помощью спектрофлуориметрии. Таким образом, описываемый 4-азидонафталин-1-сульфонилхлорид позволяет сравнительно простым способом получить новый фотоактивируемый модификатор для локализации ГТФ-связывающих центров в белках.

Похожие патенты RU2036902C1

название год авторы номер документа
АЗИДОНАФТАЛИН-1-СУЛЬФОНИЛГИДРАЗИНЫ В КАЧЕСТВЕ ПОЛУПРОДУКТОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРИЛИТИЕВЫХ СОЛЕЙ (1`R, 5`R) -3`-АЗА-1` -(2-АМИНО -1,6-ДИГИДРО-6-ОКСОПУРИНИЛ-9) -3`-ДЕЗОКСИ-3`- (АЗИДОНАФТАЛИН-1-СУЛЬФАМИДО) -ГЕКСОПИРАНОЗИЛ -6`- ТРИФОСФАТОВ - СПЕЦИФИЧЕСКИХ ФОТОАКТИВИРУЕМЫХ НЕОБРАТИМЫХ ИНГИБИТОРОВ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ 1991
  • Хропов Ю.В.
  • Мишин А.А.
  • Селиверстов В.О.
  • Кулагин С.В.
  • Кочетков С.Н.
RU2036903C1
ТРИЛИТИЕВЫЕ СОЛИ (1`R,5`R)-3`-АЗА-1`- (2-АМИНО-1,6-ДИГИДРО -6-ОКСОПУРИНИЛ-9) -3`-ДЕЗОКСИ-3`- (АЗИДОНАФТАЛИН-1-СУЛЬФАМИДО) ГЕКСОПИРАНОЗИЛ-6`-ТРИФОСФАТОВ В КАЧЕСТВЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ФОТОАКТИВИРУЕМЫХ НЕОБРАТИМЫХ ИНГИБИТОРОВ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ 1991
  • Хропов Ю.В.
  • Мишин А.А.
  • Селиверстов В.О.
  • Кулагин С.В.
  • Кочетков С.Н.
RU2036928C1
ГАЛОИДСОДЕРЖАЩИЕ 3'-АМИДОПРОИЗВОДНЫЕ(1'R,5'R)-3' -АЗА-1'- (2-АМИНО-1,6- ДИГИДРО-6- ОКСОПУРИНИЛ-9) -3'- ДЕЗОКСИГЕКСОПИРАНОЗИЛ -6'- БЕНЗОАТА В КАЧЕСТВЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ НЕОБРАТИМЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ИНГИБИТОРОВ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ 1991
  • Хропов Ю.В.
  • Баранова Л.А.
  • Туницкая В.Л.
  • Кочетков С.Н.
RU2039065C1
ЛИТИЕВЫЕ СОЛИ (1'R,5'R)-3'-АЗА-3'-(АЗИДОНАФТАЛИН-1-СУЛЬФАМИДО)-1'-(6-АМИНОПУРИНИЛ-9)-3'- ДЕЗОКСИГЕКСОПИРАНОЗИЛ-6'-ДИ-ИЛИ-ТРИФОСФАТОВ КАК СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ФОТОАКТИВИРУЕМЫЕ НЕОБРАТИМЫЕ ИНГИБИТОРЫ NA,К-АДЕНОЗИНТРИФОСФАТАЗЫ 1997
  • Хропов Ю.В.
  • Мишин А.А.
  • Селиверстов В.О.
  • Кулагин С.В.
  • Лопина О.Д.
RU2130943C1
ПРОИЗВОДНЫЕ 5`-БЕНЗОИЛГУАНОЗИНА В КАЧЕСТВЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ НЕОБРАТИМЫХ ИНГИБИТОРОВ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ 1990
  • Хропов Ю.В.
  • Пинчук Н.Я.
  • Баранова Л.А.
  • Туницкая В.Л.
  • Кочетков С.Н.
RU2035468C1
СОЛИ 3'-АМИДОПРОИЗВОДНЫХ (1'R,5'R)-3'-АЗА-1'-(6-АМИНОПУРИНИЛ-9)-3'- ДЕЗОКСИГЕКСОПИРАНОЗИЛ-6'-ДИФОСФАТА В КАЧЕСТВЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ИНГИБИТОРОВ МИОЗИНОВОЙ АДЕНОЗИН 5'-ТРИФОСФАТАЗЫ 1997
  • Баранова Л.А.
  • Хропов Ю.В.
  • Пронько Г.М.
  • Петушкова Е.В.
RU2131435C1
Литиевая соль @ -хлорацетилгидразона оксогуанозин-5-трифосфата для специфического ингибирования аденилатциклазной активности,стимулируемой гуаниловыми нуклеотидами 1981
  • Хропов Юрий Валентинович
  • Скурат Александр Владимирович
  • Богомолова Ольга Аркадьевна
  • Гуляев Никита Николаевич
SU1028675A1
Способ получения литиевых солей бромсодержащих 8-замещенных (имидазо/2,1-I/пуринил-3)- @ -Д-рибофуранозил-5 @ -фосфатов 1989
  • Хропов Юрий Валентинович
  • Кулагин Сергей Викторович
SU1713904A1
ПРОИЗВОДНЫЕ ТЕТРАФУРАЗАНО[3,4-b:3',4'-f:3",4"-j:3'",4'"-N][1,4,5,8,9,12,13,16]ОКТААЗАБ ИЦИКЛО[14.2.2]ЭЙКОЗА-4,8,12-ТРИЕНА И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ 2000
  • Шереметев А.Б.
  • Бетин В.Л.
  • Юдин И.Л.
  • Кулагина В.О.
  • Хропов Ю.В.
  • Буларгина Т.В.
  • Коц А.Я.
RU2167161C1
5- ИЛИ 6-(N-ФТАЛИМИДО)НАФТАЛИН-1-СУЛЬФОХЛОРИДЫ В КАЧЕСТВЕ ПОЛУПРОДУКТОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЗАМЕЩЕННЫХ 5-ИЛИ 6-АМИНОНАФТАЛИН-1-СУЛЬФАМИДОВ 1989
  • Палайма А.И.
  • Бутенас С.Ю.
  • Гаучене В.Л.
  • Недоспасов А.А.
SU1702645A3

Иллюстрации к изобретению RU 2 036 902 C1

Реферат патента 1995 года 4-АЗИДОНАФТАЛИН-1-СУЛЬФОНИЛХЛОРИД КАК ПОЛУПРОДУКТ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРИЛИТИЕВОЙ СОЛИ (1`R,5`R)-3` -АЗА-1`-(2-АМИНО -1,6-ДИГИДРО -6-ОКСОПУРИНИЛ-9) -3`-ДЕЗОКСИ -3`-(4-АЗИДОНАФТАЛИН -1-СУЛЬФАМИДО) ГЕКСОПИРАНОЗИЛ -6`-ТРИФОСФАТА - СПЕЦИФИЧЕСКОГО ФОТОАКТИВИРУЕМОГО НЕОБРАТИМОГО ИНГИБИТОРА РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ

Использование: в качестве полупродукта для получения специфического фотоактивируемого необратимого ингибитора РНК-полимеразы. Сущность: продукт 4-азидонафталин-1-сульфонилхлорид. Выход 39% , т. пл. 114 - 116°С, БФ C10H6ClN3O2S. Реагент 1: 4-азидонафталин-1-сульфокислота. Реагент 2: пятихлористый фосфор. Условия реакции: 60 - 80°С. 1 табл.

Формула изобретения RU 2 036 902 C1

4-Азидонафталин-1-сульфонилхлорид формулы

как полупродукт для получения трилитиевой соли (1'R,5'R) -3'-аза-1'-(2-амино-1,6- дигидро-6-оксопуринил-9) -3'-дезокси-3'- (4-азидонафталин -1-сульфамидо) гексапиранозил-6'-трифосфата специфического фотоактивируемого необратимого ингибитора РНК-полимеразы.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1995 года RU2036902C1

Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п. 1921
  • Богач Б.И.
SU3A1
Progress in thin-layer chromatography and related methods A.Niederwieser, G.Pataki, eds V.J.Acad
Press, NY, 1970, р.108-110.

RU 2 036 902 C1

Авторы

Кулагин С.В.

Селиверстов В.О.

Хропов Ю.В.

Мишин А.А.

Кочетков С.Н.

Даты

1995-06-09Публикация

1991-05-22Подача