Способ осветления реакционной смеси для фотометрического измерения биологических проб Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 

СО

с

Изобретение относится к биохимии, Касается способа осветления реакционных смесей. Цель изобретения - повышение степени осветления реакционной смеси. Для этого к реакционной смеси добавляют детергенты, пред- ставлякщие собой; а) одно или несколько ниэкомолекулярных органических соединений; б) один .или несколько прозрачно-растворимых детергентов, образующих с добавкой а) растворимый комплекс, и в заключение добавляют другой детергент до тех пор, пока осажденный комплекс не растворится. 2 табл.

со

00

см

Изобретение относится к биохимии, в частности к-способу осветления ре акционных смесей, .мутность которых вызвана, испытуемым материалом, ftpe им ественно, биологического характера, например сывороткой или плаз мой.

Целью изобретения является повьшв - Ние степени осветления реакционной смеси.

Известно, что мутность некоторых исследуемых образцов сыворотки или плазмы (липемическая сыворотка или плазма) неблагоприятно влияет на точность проведения измерения при фотометрическом анализе.

Повьшение степени осветления достигается путем добавки в реакционную смесь детергентов, которые представляют собой одно или несколько низкомолекулярных органических соединений и один или несколько прозрачно-растворимых детергентов, которые с добавкой указанных органических соединений образуют растворимый комплекс в достаточных для начала осаждения комплекса количествах, затем добавляют другой детергент до

например бутанон-2, циклогексанон и т.п.; альдегиды, например коричный аль-дегид или бензальдегид; карбоно- вые кислоты,например октановая кислота; простые эфиры, например 2-ме- токсифенол; бензол.

Среди образующих с названными сое динениями слаборастворимые комплексы

fQ детергентов, которые, в свою очередь представляют прозрачные растворы в реакционной смеси, встречаются неион генные, ионогенные и амфотерные детергенты. Предпочтительными являются

5 неионогенные аддукты полиэтиленокси- да. Особенно хорошие результаты дают алкил-, аралкил- и алкилтиоэфиры, а также сложные алкил- и аралкилзфн- ры полиэтиленоксидгликолей. В этих

20 детергентах алкильные группы обычно имеют от 8 до 22 атомов углерода, арильную группу представляет, преиму щественно, фенильный остаток, В гли- кольном остатке этих детергентов име

25 ется обычно от 3 до 25 единиц этилен оксида в конденсированном виде. Типичными примерами этих групп детергентов являются тезит, ганапол, терг тол, тритон XI00, лензодел и брий 35.

тех пор, пока осажденный комплекс снозо Кроме того, могут применяться также.

ва не растворится.

Применяемыми соединениями являются: ароматические (конденсированные и неконденсированные) спирты и аминь, предпочтительно такие, которые сильно 35 электроотрицательно замещены (предпочтительными электроотрицательными заместителями являются галогены), например бензиловый спирт, фенол, моно-, ди- и трихлорфенолы, дибром- и три- 40 бромфенолы, крезолы, нафтолы, дигидро- оксинафтолы, анилин и хлоранилин, ме- тиланилин} сложные зфиры ариловых кислот и алкиловых кислот, например этш1Овь1Й эфир п-гидроксибензойной кис 45 лота, этиловый эфир уксусной кислоты, бутиловый эфир уксусной кислоты, этиловый эфир пропионовой кислоты, этиловый эфир трихлоруксусной кислоты и т.п.J неразветвленные и циклическиегп и разветвленные алифатические спирты с более чем 3 атомами углерода, например амиловый спирт, октанол, до- деканол, циклогексанол и т.п.; гало- генированные алифатические соединения с короткой цепью атомов, например, дихлорэтан, трихлорэтнлен, тетрахлор- метан, дихлорбутен тетрахлордифтор- этан и т.п.; алифатические кетоны,

например бутанон-2, циклогексанон и т.п.; альдегиды, например коричный аль-дегид или бензальдегид; карбоно- вые кислоты,например октановая кислота; простые эфиры, например 2-ме- токсифенол; бензол.

Среди образующих с названными соединениями слаборастворимые комплексы

Q детергентов, которые, в свою очередь, представляют прозрачные растворы в реакционной смеси, встречаются неионо- генные, ионогенные и амфотерные детергенты. Предпочтительными являются

5 неионогенные аддукты полиэтиленокси- да. Особенно хорошие результаты дают алкил-, аралкил- и алкилтиоэфиры, а также сложные алкил- и аралкилзфн- ры полиэтиленоксидгликолей. В этих

0 детергентах алкильные группы обычно имеют от 8 до 22 атомов углерода, арильную группу представляет, преимущественно, фенильный остаток, В гли- кольном остатке этих детергентов име5 ется обычно от 3 до 25 единиц этилен- оксида в конденсированном виде. Типичными примерами этих групп детергентов являются тезит, ганапол, терги- тол, тритон XI00, лензодел и брий 35.

ионные детергенты, в частности хлориды алкилдиметилбензиламмония. Вторичные алкилсульфаты, алкильные группы которых соответствуют названному определению, также пригодны, Кз амфотер- ных детергентов пригоден N-лаурил- диэтаноламид.

Способ осуществляют следующим образом.

Подбирают низкомолекулярное соединение в количестве 0,5-300 мМ, преимущественно 0,3-3,3 г/л, растворяют его в буферном или солевом растворе, приливают к этому раствору малыми порциями прозрачный раствор детергента в количестве 0,05-i %, предпочтительно 1-30 г/л реакционной смеси, таким образом, чтобы при обработке испытуемого низкомолекулярного соединения детергента произошло помутнение.раствора.

Если произошло помутнение (которое показывает, что могут быть использованы оба вещества), то полученную смесь прибавляют к анализируемой пробе в указанных количествах так, чтобы было заметно дополнительное помутнение. Затем прибавляют порциями тот же или другой детергент до тех

10

15

ор, пока помутнение не исчезнет совем. Обработанная таким образом иследуемая проба сыворотки или плазмы ерется для анализа.

Предпочтительно использование еньших количеств детергентов из-за их возможного негативного влияния на активность ферментов, при этом реомендуется применение по крайней мере одного или двух различных детер- гентов.

Способ применим к видам измерений, при которых мутность может привести к искажению или помехам измерения,в частности в реакционных смесях, которые предназначены для фотометрических измерений. Такие реакционные смеси известны (Бергмайер Г,У. Методы ферментного анализа. - Химия, Вайн- „ гейм/Бергштрассе).

В табл.1 и 2 (примеры 1-20) приведены типы низкомолекуляриых соединений, их соответствующие концентрации, концентрации детергента тезит (Thi- sit) и величина рН,.

В примерах 21-36 в растворе, который содержит низкомолекулярное соединение (2,4-дихлорфенол) в определенной концентрации, варьируются раз- д личные детергенты,

В примерах 37-39 даны концентрации реактивов определенного фотометрического теста, в которых помутнение сильно мешает и поэтому устранено добавками, содержащимися в реактиве.

Сущность способа состоит в том.

25

35

Для удаления мутности вводят следующие добавки, %: бутиловый эфир - уксусной кислоты 2, тезит (добавка А) 1,5; дихлорэтан 0,5; гексанол 0,5;

что малорастворимый комплекс, который образуется сначала, снова растворя- генапол Х-0 (изотридеканолполиглико- ется при добавлении другого детерген- левый эфир) 5; генапол Х-100 (изотри- та и при этом также растворяется подлежавшая устранению мутность в растворе анализируемой пробы. Причем при

деканолполигликолевый эфир) 9; зит (добавка Б) 6.

Условия опыта: 2 мл реагента

те(с

применении детергента, отличающегося д добавками А или Б),. 0,1 мл пробы.

от первого, его используется меньше.

Примеры 1-36. Осветляющие системы.

Предлагаемые комбинации в течение от .1 мин до максимально 2 ч удаляют муть в системе: 2 мл испытуемой сме- I си 20 мкл молока жирностью 3,5% при толщине слоя 1 см, для волны 546 им, при 25°С.

Вариация юстировки. Используют 0,1 М трис-НС1 буферный раствор с 2% 7Н-г.О.

Вариация детергентов. В 0,1 М трис-НС1 буферном растворе (рН 8,0)

50

старт с 0,6 V уриказы ЕС J.7,3.3.

Измерение проводят при давлении 340 нм и в конечной точке.

Указанные добавки способствуют тому, что значительно повышенные ли- пемически мутным испытуемым материалом начальные экстинкции быстро уменьшаются. Мутность от экстинкции 2,0 за 10 мин уменьша- gg ется до стабильного уровня экстинкции порядка О,2 относительно показаг теля холостого опыта,

П р и М е р 38, Реагенты для определения холестерина в .сьюоротке.

0

5

д

с 2% MgS04 7HiO и 8 мм/л 2,4-дихлор- фенола в качестве добавки с использованием детергентов, приведенных в табл.2, получают хорошее осветление смеси.

В табл.2 приняли следующие названия: тезит - гидроксиполиэтоксидо- декан, тергитол NPX - 10,5-этоксино- нилфенол, тритон Х100 - 9,10-этокси- октилфенол, пегосперза - полизтилен- гликольлауриловый эфир, теепол 7 О и лензодел АВ6 - смешанные вторичные алкилсульфаты (с Cg ДО С-ц), твин 20- 20-этоксисорбитанмоиолаурат,.брий 35 - полиоксиэтиленлауриловый эфир, гена- пол 0x80 и генапол XI00 - полиглико- левый эфир спиртов жирного ряда (с прямой цепью с С j; до .

Пример 37. Реагенты для определения мочевой кислоты в сыворотке. Рецептура: 0,05 моль/л 10 об.% этанола; установлено НС1 на рН 8,5; 1 мг/мл ТПН (трифосфопиридин- 5 нуклеотид); I v/мл алкогольдегидрЬг е- назы ЕС 1.2.1,5; 1000 v/мл катала- зы ЕС 1.11.1.6; 0,05 моль/л Na щавелевой кислоты; 0,05 моль/л пиразола.

Заданная длина волны измерения и относительно большой необходимый расход проб обусловлень тем, что при ли- пемически мутном испытуемом материале измерение затрудняется или становится вообще невозможным.

Для удаления мутности вводят следующие добавки, %: бутиловый эфир - уксусной кислоты 2, тезит (добавка А) 1,5; дихлорэтан 0,5; гексанол 0,5;

35

генапол Х-0 (изотридеканолполиглико- левый эфир) 5; генапол Х-100 (изотри- генапол Х-0 (изотридеканолполиглико- левый эфир) 5; генапол Х-100 (изотри

деканолполигликолевый эфир) 9; зит (добавка Б) 6.

Условия опыта: 2 мл реагента

те(с

добавками А или Б),. 0,1 мл пробы.

старт с 0,6 V уриказы ЕС J.7,3.3.

Измерение проводят при давлении 340 нм и в конечной точке.

Указанные добавки способствуют тому, что значительно повышенные ли- пемически мутным испытуемым материалом начальные экстинкции быстро уменьшаются. Мутность от экстинкции 2,0 за 10 мин уменьша- ется до стабильного уровня экстинкции порядка О,2 относительно показаг теля холостого опыта,

П р и М е р 38, Реагенты для определения холестерина в .сьюоротке.

Рецептура; 2,54 г/л 31,60 г/л K2HP04S 8 г/л 200 мг/л 4-aMHHoaHTHnHpHHaj 282 мг/л фенола; рН 7,90, 3 v/мл холестеринэс теразы ЕС 3.1.1.13; 0,3 v/мл холес- т риноксидазы ЕС 1.1,3.6,

Этот реагент является смесью, полученной в одном аппарате одностадийной смесью, и поэтому может применят ся без изменения показателя холостого опыта, Вьшолнение этого требования обеспечивается следующими добавками (и для липемически очень мутного испытуемого материала). Освет- ляющие добавки: 815 мг/л 3,4-дихлор- фенола, 4 г/л генапола Ох-100 и 3 г/л дезоксихолата натрия; 2 г/л Г ептанола и 8 г/л тезита; I г/л этилового эфира уксусной кислоты и 7 г/л тезита; при рН 7,0 в 80 мМ К /Na -фосфатнр буфере; 1,5 г/л этилового эфира парагидроксибензойной кислоты и 4 г/л тезита; при рН7,50 в 0,2 М калийногфосфатном буфере.

Дополнительно к необходимым для образования цвета 3 ммоль/л фенола применяют 35 ммоль/л фенола; 1,5 г/л генапола Ох-100; 1,5 г/л твина 20; 1,0 г/л холата натрия.

Условия опыта: 2 мл реагента + 20 л пробы, 546 нм, .

Вызванная испытуемым материалом мутность экстинкции 1 1,5 в течение необходимого для реакции промежутка времени удаляется полностью или до в личины, которой можно пренебречь,

Пример 39. Реагенть для определения глюкозы в сыворотке.

Рецептура: 14,,9 г/л Na2HP04; 13,2 г/л KHjPO ; 8,0 г/л Na2S04, 30 v/мл глюкозооксидазы ЕС 1,1.3,45 1,8 v/мл пероксидазы ЕС 1,11,1,7; 0,2 v/мл эстеразы ЕС 3.1.1.13; 470 мг/л фенола; 156 мг/л 4-амино- йнтипирина, при рН 7,0,

Осветляющие добавки: 814 мг/л 3,4-дихлорфенола9 3,6 г/Л генапола Ох-100 и 3,0 г/л таурогликохолевой КИСЛОТЫ} 814 мг/л 3,4-дихлорфенола, 2,5 г/л тезита и 3,9 г/л таурогликохолевой кислоты, В 0,2 М калийно-фос фатном буфере, рН 7,0, дополнительно ,35 Г/л фенола, 489 мг/л 3,4-дихлор

0

5

0

5

0

5

0

фенола, 3,0 г/л генапола Ох-100 и 2,8 г/л холата натрия. ,

Измерение осуществляют при давлении 578 нм. Аналогично примеру 38 используемые добавки способствуют тому, что вызванная испьгтуемым материалом мутность в данных условиях опыта уменьшается в кратчайшее в{5емя.

Приведенные примеры включают такие, при которых применяют: один или несколько прозрачно-растворимых детергентов, которые с добавкой могут образовывать слабее растворимьй комплекс, и такие, при которых дополнительно к указанным применяют по крайней мере один детергент, который не может с добавкой в реакционной смеси образовать слабее растворимый комплекс (отмеченный знаком).

Формула изобретения

Способ осветления реакционной смеси для фотометрического измерения биологических проб путем внесения в пробу детергентов, о тличающий- с я тем, что, с целью повышения степени осветления, дополнительно вводят низкомолекулярное соединение, выбранное из группы: фенол-25,3 или 2,4-ди- хлорфенол ,или 2,4,6-трихлорфенол, 2,4- дибромфенол, 1,5- или 1,7-,или 2,7- дигидроокси 1афтол, гидрохинон, анилин, 2-хлоранилин, о-толуидин, хлороформ, бензол, гваякол, бензельдегид, коричный альдегид, циклогексанон,при рН 7,1-8,0 и натриевую соль октановой кислоты при рН 5,0, которые вносят в количестве 0,3-3,3 г/л реакционной смеси, далее вносят один или два детергента, выбранных из группы: гидро- ксиполиэтоксидодекан, 0,5-этоксино- нилфенол, полигликолевый эфир спиртов алифатического ряда с числом углеродных атомов в прямой цепи от 12 до 15, 9,1 О-этоксиоктилфенол,полиэти- ленгликольлауриловый эфир, смесь вторичных алкилсульфатов с числом углеродных атомов в алкильном фрагменте от 8 до 18, 20-этоксисорбитан- монолаурат, полиоксиэтиленлаурило- вый эфир, которые используют в количестве 1,2-30 г/л реакционной смес-и.

Таблица J

31 Твин 20

32 Брий 35

, 33 Генапол 0x80

34

Твин 20

14А381610

Продолжение табл.2

бромид аммония

бис-(2-Гияро- ксиэтил)-амин лауриновой кислоты

бис-(2-Гидро- ксиэтил)-амин лауриновой кислоты

Додецилсуль- фатнатриевая соль (в присутствии катионов)

Цетилтриме- тилбромид ам