Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pER-33,кодирующей зрелый @ -интерферон человека Советский патент 1988 года по МПК A61K38/21 

см

Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к способу получения плазмиды, пригодной для получения интерферона типа d .,

Предлагаемый способ получения плаз- МИДЫ, кодирующей зреЛый о/-интерферон

человека, заключается в том, что плазмиду pER 103, .которую получают путем расщепления pBR322 эндонуклеазами с последующим удалением Есо Rl-Hind Ill-фрагмента длиной 29 Ьр и введением ДНК-последовательности формулы

Изобретение относится к области генетической инжекции, в частности к способу получения плазмиды, пригодной для получения интерферона типа о. Предлагаемый способ получения рекомй, бинантной плазмиды заключается в том, что в плазмиду pER 103 вводят промотор-операторный RBS-фрагмент, после обработки Hind HI эндонуклеазой и фосфатазой данную плазмидную ДНК через линкерную последовательность легируют с 1РЫ-о -последов 1тельностью, причем в полученную таким образом плазмиду через EcoRI-Bam HI линкер вводят par-Lokus, выделенный EcoRI эндонуклеазой из плазмиды рРМ 31, или же ДНК фрагмент длиной л/130 Ьр, полученный путем обработки плазмиды pER 33 ферментами EcoRI и Ват HI. I СО

5 AATTCACGCTGATCCCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3 GTGCGACTAGCGATTTTGTAAGACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG

I Promotor -

GCGAACCAGTTAAGTAGTACAGAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTA CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCCATTCCTCCAAATTCGA Promotor/Operator

20

в результате реакции лигирования пос- ле его обработки Hind ИГ и фосфата- зой спивают с линкерной последовательностью формулы

LinkerИ

AGGTTAAAGATGTGT

ATTTGTACACAGTAG

ИН FN-o/-Gen

к которой присоединяют кодирующую IEN- i -последовательность, причем дополнительно в полученную таким образом плазмиду через Есо Ri-BamHI-линкер вводят par-Lokus, выделенный Есо RI эндонуклеазой из плазмиды рРМ 31, или же ДНК-фрагмент длиной примерно 1300 Ър, полученный путем обработки 30 плазмиды pER33 ферментами Есо RI и Вага HI.

Конечную плазмиду трансформируют в Escherichia coli НВ 101, и отбирают

25

DMTr-0Чо

у

IГ

Si-(CH2)3-N-CO-(CH2)2-CO-0

OC2Hj

ОС2Н5 Н

Удельная нагрузка составляет 68- 104 мкмоль нуклеозида на 1 г материала-носителя.

П р и м е р 2.- 5 -Диметикситритил- дезокситимидин-3 -хлорметоксифосфит.

Полностью защищенные нуклеозид-3 - хлорметоксифосфиты синтезируют по 50 .известным способам, 544,6мг (1,0ммоль) 5 -диметокситритил-тимидина (DMTrTd; растворяют в 1,О мл абсолютного ТГФ и этот раствор при -78°С в течение 15 мин в атмосфере аргона прикапывают к перемешиваемому раствору 0,9 мкмоль метилдихлорфосфита в 0,5 мл абсолютного пиридина и 2,0 мл абсолютного

нужные клоны, трансформированные плаз- мидой и культивируют их известными методами.

Изображение иллюстрируется следую щими примерами.

И р и м е р 1. Функционализацию полимерного материала-носителя осуще- .ствляют по известным способам. В качестве материала-носителя служит HPLC- силикаГель (Macherey SNageL), размер зерен 20 мкм, размер пор 200 А). Его дериватизируют методом Mateucci и .Caruthers, за исключением того, что стадию сукцинирования осуществляют с помо.щью ангидрида янтарной кислоты в безводном пиридине. Защищенные нук- леозиды таким образом связывают ковалентно с силикагелем соответстен- но следующей формуле

DMTr-0ТГФ. Через 10 мин реакционный раство нагревают, до комнатной температуры и центрифугируют. Надосадочную жидкость переносят с помощью пипетки в сухую заполненную аргоном колбу со шлифом (25 мл). При комнатной температуре растворитель отсасывают в ва- .кууме, затем добавляют по 0,5 мл толуола И ТГФ и снова выпаривают, причем в качестве продукта остается бесцветное вспененное твердое вещество. Этот продукт не анализируют на его чистоту, а растворяют в 10,0м абсолютного пиридина и этот раствор хранят под аргоном при -20°С вплоть

/до дальнейшего применения (максимально в течение одной недели).

П р и м е р 3. 5 -Диметокситритил- N -изобутирил-дезоксигуанозин-З -хлор- метоксифосфит.

Аналогично примеру 2 получают -раствор этого нуклеозидфосфорохлоридита в 10,0 мл пиридина из 640,0 мг (1,0 ммоль- З -диметокситритил-N -изобутил-дезок- сигуанозина.

Пример4. 5 -.Т иметокситритилсмесью н-бутанол-дутид

в)осуществляют 4 п абсолютным пиридином;

г)неконденсировани нуклеотидной единицы: го раствора 5 -диметок ситимидин-З -хлорметок мер 5) (примерно 100 м

Q гоном добавляют, в фрит му носителю и его встр воре, время реакции со

д)осуществляют 3 п

N-бензоил-дезоксицитидин-З -хлорметок-- абсолютным пиридином; сифосфит.

Аналогично примеру 2 получают раствор этого нуклеозидфосфорохлоридита в 10.,О мл пиридина из 683,7 мг (1,0 ммоль) 5 -диметокситритил-N 15 е) осуществляют оки три-эфиром фосфористой мощью 100 мг иода, рас 3 мл смеси из ТГФ, луг (2:2:1), время реакции

бензоил-гдезоксицитгидина.

ПримерЗ. 5 -Диметокситритил- N -бензоил-дезоксиаденозин-З -хлор30

метоксифосфит,

Аналогично примеру 2 получают раствор этого нуклеозидфосфорохлоридита в 10,0 мл пиридина из 657,7 мг (1,0 ммоль) З -диметокситритил-Ы - бензоил-дезоксиаденозина.

П р и м е р 6. Синтез d-TCCTTA.

50 мг (5 мкмоль) содержащего MTrdA полимерного носителя (см, пример 1) вносят в стеклянную фритту Соответственно .следующему шагу затем обавляют различные растворители и растворы реактивов; носитель в ней кратковр еменно встряхивают и раствор после желательного взаимодействия снова удаляют тем, что с помощью тока аргона его вытесняют вверх через

фритту.

Ч40

а)Отщепляют ВЖг-группы с помощью

3 мл раствора из 70 г бромида цинка, 00 мл нитрометана и 5 мл воды, время реакции 10 мин;

б)осуществляют 4 промывки по 3 мл

25

35

45

498

.Нагрузка (мкмоль/г)2а О2бция)(Фактор разбавления)

вес носителя (мг)

можно рассчитать загрузку материала- носителя диметокситритильными защитными группа ми. Получают 43 мкмоль/г. Это соответствует среднему выходу 83% на. стадию конденсации.

Отщепление метильных остатков от триэфирных групп фосфорной кислоты.

Материал носителя в течение 43 мин встряхивают в 4 мп раствора тиофено- ла, триэтиламина и диоксана (1:1:2),

смесью н-бутанол-дутидин-ТГФ (4:1:5);

в)осуществляют 4 промывки по 4 мл абсолютным пиридином;

г)неконденсирование ближайшей нуклеотидной единицы: 1 мп пиридинового раствора 5 -диметокситритил-дезок- ситимидин-З -хлорметоксифосфита (пример 5) (примерно 100 мкмоль) под аргоном добавляют, в фритту к полимерному носителю и его встряхивают в растворе, время реакции составляет 10 мин;

д)осуществляют 3 промывки по 3 мл

абсолютным пиридином;

е) осуществляют окисление сложным три-эфиром фосфористой кислоты с помощью 100 мг иода, растворенного н 3 мл смеси из ТГФ, лугидина и воды (2:2:1), время реакции 7 мин;

ж) осуществляют 3 промывки по 4 мл

ТГФ;

з) ацетилируют непревращенные З - ОН-группы с помощью раствора 150 мг 4-диметиламино1Шридина, 0,3 мл кол- лидина, 0-, 25 мп ацетангидрида и 2,5 мл ТГФ, время реакции 3 мин;

и) осуществляют 4 промывки по 3 мл нитрометаном.

Цикл от а) до и) повторяют теперь четыре раза, причем на стадии г) используется необходимый для последовательности нуклеотидный структурный элемент.

После приконденсирования последнего нуклеотидного структурного элемента материал носителя высушивают в вакууме масляного насоса, пробу взве- щивают с точностью до 1 мг и смешивают с 10,0 мл 0,1 М раствора толуол- сульфокислоты в ацетонитриле. Путем происходящего при этом отщеплении ди- метокситритил-катиона получают оранжево-красный окрашенный раствор, абсорбция которого измеряется при 498 нм. По формуле

498

50

55

затем промывают метанолом, после этого эфиром.

Материал носителя в течение 14 ч нагревают с 10 мл концентрированного аммиака при , водный раствор затем отсасывают и фильтрат концентрируют в вакууме примерно до 2 мл.

Полученный сырой продукт, содержащий на 5 -конце диметокситритильную группу, подвергается воздействию об 5 . 14 ратимой фазы HPLC. Колонна -Bonda- pak С. фирмы Waters; элюант: 0,1 М триэтиламмонийацетатный буфер с рН 7 с 25% ацётонитрила; истечение 2 мл/ /мин; время удержания 14 мин Со.бран- иыб фракции лосле элюирования концентрируют примерно до объема 1 мл., смешивают с 10 мл 80%-ной уксусной кислоты и оставляют на 30 мин при . комнатной температуре. Затем концентрируют в вакууме при досуха, остаток растворяют в 25 мл воды и отщепленный диметокситританол экстрагируют 3 раза по 15 мл эфиром. Водную фазу снова концентрируют досуха, остаток растворяют в 2,5 мл воды, обессоливают на биогеле Р 2.Сколонна: 60 X 1,7 см) и диофйлизируют.

В качестве контроля чистоты служит аналитическая HPLC-диаграмма. Колонна 300 X 3,9 мм, p-Bondapak фирмы Waters; элюанты: 0,1- М триэтилам™ монийацетатный буфер с рН 7 с 12% ацётонитрила; истечение 1,5 мл/мин, время удерживания 3,7 мин.

Пример 7. Синтез d-TAAGGAGGTTTA.

Получают аналогично примеру .6 ис- ,одя из 300 мг. (30 мкмоль) DMTrdA -P

HPLC-диаграмма продукта: колонна 300 X 3,9 мм, fx-Bondapak С/, фирмы Waters; элюант 0,1 М триэтиламмонийацетатный буфер с рН 7 с 12% ацето- .нитрила; истечение 1,5 ил/мин, время удерживания 4,4 мин.

И РИМ е р 8/ Синтез d-ACCTTAAACC

Получают аналогично примеру б исходя из 200 мг (16 мкмоль) DMTrdC -P.

HPLC-диаграмма продукта: колонна 300 X 3,9 мм, (U-Bondapak С(, фирмы Waters; элюант 0,1 М триэтиламмонийацетатный буфер с рН 7с 12% ацётонитрила; истечение 1,5 мл/мин, время удерживания .3,4 мин. П р и М е р 9. Синтез d-CATCTTTA.

Получают аналогично примеру 6 ис - ходя из 150 мг ( 1,32 мкмоль) DMTrdA -P.

HPLC-диаграмма продукта: колонна 300 X 7,8 мм, |U-Bondapak С g фирмы Waters; элюант: 0,1 М триэтиламмонийацетатный буфер с рН 7с 20% ацётонитрила; истечение 1,5 мл/мин; время удерживания 7,7 мин.

ПрИ Мер 10, Синтез d-AGCTTAAAGATG

Получают аналогично примеру 6 исходя из.. 200 мг (16,2 мкмоль). DMTrdG Р.

V

800 6

HPLC-диаграмма продукта: колонна.. 300 X 7,8 мм, |U-Bondapak С. фирмы Waters; элюант 0,1 М триэтиламмонийацетатный буфер, рН 7 с 26% ацётонитрила; истечение .1,5 мл/Мин; время удерживания 5,2 мин. . П р и М е р 11 . Синтез d-TGTGATCTGCCTCA;

Получают аналогично примеру 6 ис- 0 ходя из 250 мг (22 мкмоль) DMTrdA -P.

HPLC-диаграмма продукта: колонна 300 X 7,8 мм, (U-Bondapak С- фирмы Waters; элюан-т 0,1 М триэтиламмонийацетатный буфер, рН 7 с 25% ацетонит- 5 рила; истечение 1,5 мл/мин; время удерживания 6,1 мин.

Пример 12. Синтез d-CAGATCACA. Получают аналогично примеру 6 исхо- , дя из 150 мг (13,2 .мкмоль) DMTrdA -P. 0 HPLC-диаграмма продукта: колонна 300 X 7,8 мм, wBondapak фирмы Waters; элюант 0,1 М триэтиламмоний-. ацетатный буфер с рН 7 с 20% ацётонитрила; истечение 0,2 мл/мин; время 5-удерживания 5,2 мин.

Анализ последовательностей синтетически полученных олигодеоксинуклео- тидов осз ществляют посла того, как они встроены в интерферрнпродуцирую-, 0 щую плазмиду pER 33.-С, помощью этого анализа одновременно подтверждают правильность последовательности оснований в олигооксинуклеотидах.

П р и М е р 13. Плазмида рВР 101, которая содержит примерно фрагмент размером Ю ОО Ьр, кодирующий трипто- фановый оперон Serratia marcescens, представляет собой- исходный ма.териал для выделения промотор-операторной области. Эта регуляторная область находится . внутри Есо RI-Hae Ill-фрагмента длиной 90 Ьр, в котором промо- тор -ориентирован в направлении Есо RI-- Нае III.5 Примерно 25 мг плазмиды рВР 101 переваривают рестрикцис1нно.й эндонуклеа- зой Есо RI, два образующихся фрагмента отделяют друг от друга путем гель- электрофоре з а (1,4% агарозы) и-фраг0 мент длиной 200 Ьр электтрофоретически элюируют из геля. Этот фрагмент затем переваривают с. помощью Нае III, оба продукта переваривания разделяют на - 6%-ном полиакр иламидном геле и фраг

5 мент длиной 90 Ьр (промотор-оператор) - снова выделяют из -геля.

RBS составляют из 3-х синтетичес ких олигонуклеотидов: 6-мера 5 -ТССТТА, 10-мера 5 -AGCTTAAACC и 12-мера 55

Q

7141

TAAGGAGGTTTA. 500 n-моль 6-мера фос- .форилируют с помощью фермента полн- нуклеотидкиназы и при этом радиоактивно маркируют. Реакционную смесь в течение 10 мин нагревают при , чтобы .инактивировать киназу, после чего добавляют эквимолярные количества (не фосфорилированных) 10-мера и 12-мера, смесь олигонуклеотидов нагревают до и затем медленно (примерно через 3 ч) охлаждают, до 30- 35 С, причем олигонуклеотиды гибриди-. зуются один с другим:

12 тег

dTAAGGAGGTTTA dATTCCTCCAAATTCGA

бтег 10 тер

Благодаря добавке 0,25 мкмоль АТР и 5 мкмоль ДТТ 6-мер и 10-мер с помощью фермента ДНК-лигазы ковалентно связывают друг с другом. Отсутствие фосфатных остатков на 5 -концах 12- мера и 10-мера предотвращает возникновение многомерных продуктов лигатуры. После реакции осуществляют нагре- .вание в течение 10 мин при , чтобы инактивировать лигазу, после чего добавляют 0,5 ммоль АТР и 5 ммоль ДТТ в дальнейшую реак1щю киназы также ки- назируют 5 -концы 12-мера и .10-мера, благодаря чему получается RBS.

12 пмоль Есо RI-Hae-III-промотор- операторного фрагмента длиной 90 Ьр лигируют в стандартных условиях с помощью 60 пмоль RBS. Полученный благодаря Нае III разрезу тупой конец фрагмента размером 90 Ьр легируют с тупым концом RBS и получают молекулы, в которых содержат RBS в направлении ориентации вниз от промотора. После реакции лигазу инактивируют в течение 10 мин при , устанавливают концентрацию ТА-буфера и дополнительно переваривают с помощью 200 единиц Hind III и 10 единиц Есо RI.

В образующихся в реакции мульти- мерах наряду с желатальной реакцией могут, лигироваться друг с другом как Есо RI-концы, так и также Hind III- концы и снова превращаться в мономеры. Затем пробу разделяют на 6%-ном полиакриламидном геле и вырезают из геля промотор-операторный RBS-фраг- мент. размером 100 Ьр, который имеет

08

Есо RI- и Hind Ill-концы электрофо- ретически элюируют, 1тобы отделить от избытка нелигированного RBS. При этом ответственная за экспрессию часть экспрессионного плазм11да готова.

Примерно 2 мг плазмлды pBR 322 разрезают с помощью рестрикционных

ферментов Есо RI и Hind III, причем образуются два фрагмента:- большой с 4382 Ьр и малый с 29 Ьр. Большой фрагмент путем -электрофореза на 0,8%-ном геле агарозы отделяют от маленького

фрагмента, вырезают из геля и элюируют. Примерно 0,4 пмоль этого фрагмента затем лигируют с 10 (пмолями промотор) onepafop-RBS-фрагмента.

pBR 322-фрагмент из-за своих двух

не подходящих друг к другу выступающих концов не может лигироваться сам с собой, поэтому промотор-операторный RBS-фрагмент может лигироваться только в одной ориентации в плазмиде в

направлении Hind III-сайта, до тетра- циклинрезистентного гена pBR 322.

Escherichia coli KB 101 трансформируют с помощью реакционной смеси последне:го лигирования известным образом, трансформанты селекционируют на содержащих ампициллин агаровых пластинках. Для этого Е-.coli НВ 101- клетки выращивают до плотности примерно 2 X 10® клеток/мл. Клетки пеллети- руют и суспендируют в 100 мкмоль раствора CaClj (20 при ). После этого клетки инкубируют с реакционной смесью реакции лигазы в течение 5 мин при О - 4° С и в течение 5 мин при

37°С. После добавки 0,5-1 мл 1-бульо- на инкубируют далее в течение 15- 30 мин при 37°С. Выбирают 19 трансформантов и с помощью Нйе 111-рестрик- ционных -перевариваний испытывают на

их возможное содержание промотор-операторного RBS-фрагмента. pBR 322/Нае- Ш-фрагмент длиной 192 Ьр заменяют 264 Ьр-фрагментом (16 Ьр размером Нае III с сайтом на конце в pBR 322

50

влево от Есо RI-сайта + 103 Ьр промотор/операторного RBS-фрагмента + -+ 145 Ьр Hind Ill-места среза вплоть до ближайшего Нае dIII-места среза вправо от него, в 322). Из 19 . gg отобранных трансформантов 18 обладают ожидаемым образцом переваривания.

Для того чтобы установить правильность сконструированной экспресссион- ной плазмиды одну из этих плазмид

(pER 103) подвергают последовательному анализу и его положение устанавливают в pBR 322. Последовательный анализ проводят по методу Махат и Gilbert в направлении от Есо Rl-сайта в направлении Hind III-санта (и сверх 1него), как также от Hind-III-сайта в направлении Есо RI-сайта (и сверх него).

Плазмида pER 103 таким образом содержит промотор-операторную область триптофанового оперона Serratia marce scens в, комбинации с синтетической RBS. Новая плазмида прокотирует транс крипцию генов, которые встраиваются в его Hind I II-сайт, и позволяет осуще- , ствлять эффективную трансляцию этих

продуктов транскрипции.

I

Пример 14, Примерно 1 мкг Pst 1-вставки 1F17 переварива:ют с помощью Sau ЗА и из полиакрил- амидного геля выделяют фрагмент длиной 177 Ьр, который простирается от Sau ЗА-сайта на NHj-концевом цистеи- новом кодоне вплоть до ближайшего Sau ЗА-сайта и содержит Ava Ill-сайт, Его обрабатывают 1 единицей щелочной фосфатазы и после удаления фосфатазы благодаря экстракции фенолом и эфир ром осаждают с помощью этанола. Фрагмент затем обрабатывают Ava II, благодаря чему получают желательный фрагмент 34 Ьр Sau 3A-Ava II и 143 bp- фрагмент,

12 тер

AGCTTAAAGATGTGTiGATCTGCCTCA

3 ATTTCTACACACTAckc t„j tI I

Hind Ш

8mer9mer

Ii

Mel Cyc

Получают 4 синтетических олигонук- леотида, а именно 14-мер -

TGTGATCTGCCTCA, 1 2-мер 5 -AGCTTAAAGATG 9-мер 5 -CAGATCACA и 8-мер 5 -

САТСТТТА.

По 250 пмоль 8-мера, 9-мера и 14-мера фо сфорилируют после реакции киназу инактивирувдт путем нагревания при 95 С, добавляют 250 пмоль неки- назированного 12-мера и олигонуклео- тидную смесь медленно (примерно

780010

Параллельно этому из плазмиды1Р17 препарируют интерферонспецифический Ava II-фрагмент размером 646 Ьр, который простирается от Ava 11-сайта внутри Sau ЗА-фрагмента размером 177 Ьр за концевой кодон. Примерно 0,5 мкг этого Ava II-фрагмента размером 646 Ьр вместе со смесью из

Q 34 Ьр и. 143 Ьр Sau 3A-Ava

II-фрагментов инкубируют с ДНК-лига- вой. Образующиеся благодаря этому фрагменты Ava II, которые ковалентно связаны, фланкируют Ava Il-Sau ЗА- . 5 фрагментами. Как только Ava Il-Sau ЗА-фрагмент лигируется с фрагментом Ava II, на этом месте не может более происходить никаких других лигироваг. НИИ, так как Sau ЗА-концы дефосфори0 лируются. После лигирования осуществляют нагревание в течение 10 мин при , чтобы инактивировать фермент, затем добавляют 5 мкмоль ДТТ и 0,25 мкмоль АГР и дефосфорилированные

5 Sau ЗА-концы снова кинезируют. Реакционную смесь разделяют на 6%-ном по- лиакриламидном геле и молекулы в области 700-800 Ьр (646 Ьр Ava II-фрагмент фланкирован двумя Ava Il-Sau

0 ЗА-фрагментами) и в области 1300- 1500 Ьр (два друг с другом лигирован- ные 646 Ьр Ava II-фрагменты фланкироч ваны Ava Il-Sau ЗА-фрагментами) элю- ируют.

Получение олигонуклеотидного ком35

плекса формулы 14гпер

Sau ЗА

в. течение 3 ч) охлаждают до 35 С, чтобы сделать возможной гибридизацию олигонуклеотидов. Затем после добавки 5 мкмоль ДТТ и 0,25 мкмоль АТР олигонуклеотиды лигируют друг с другом. Отсутствие фосфатного остатка на 5 -конце 12-мера предотвращает образование димеров; выступающий нец 14-мера не самокомплементарен, он не может приводить к димеризации.

11

Лликвотную часть (25 пмоль) лиги- рованного олигонуклертидного комплекса переваривают с помощью 80 единиц Sau ЗА, чтобы получить подобающий интерфероногену Sau ЗА-конец. Затем пробу нагревают в течение 10 мин при 75 С, экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Таким образом, последовательный фрагмент, который связывает интерфероноген с Hind 11Г-.срезанным pER 103 согласно изобретению, г отов.

Связывание интерфероногена и оли- гонуклеотидного комплекса, лигирова- ние в pER 103. .

Изолированные фрагменты интерферона, которые представляют собой примерно 1 пмоль молекул, связывают с Sau ЗА-разрезанным олигонуклеотидным комплексом (примерно 25 пмоль) путем лигирования когазивных Sau ЗА-коицо.в. Снова отсутствие фосфатного остатка на Hind Ill-конце олигонуклеотидного комплекса (12-мер) предотвращает возникновение мультимеров. Образуются молекулы интерфероногена, которые с обеих сторон олигонуклеотидного комплекса фланкирова.ны свободными Hind Ill-концами. После денатурирования. при нагревании .лигазы и добавки 5 мкмоль ДТТ и 0,25 мкмоль АТР .эти концы фосфорилируют, -затем осуществляют, осаждени е с помощью из опро пано- ла, чтобы отделить также образовавшиеся в реакции лигирования димеры олигонуклеотидного комплекса. После этого конструкцию лигируют с помощью 0,05 мкг Hind III, обработанной эндо- нуклеазой и фосф.атазой плазмиды pER 103. Обработка фосфатазой Hind Ill- разрезанной плазмиды уменьшает его рециркуляцию в реакции лигировання. Таким образом, смесь плазмиды готова, она содержит до 50% продуцирующих интерферон -плазмид (а-именно тех плаз- ид,. которые получают из Э4 Ьр Sau 3A-Ava 1Г-фрагмента в лигировании с помощью 646 Ьр Ava II-фрагмента на начал.е гена. .

Трансформация Es cherichia coli. ИВ 101 и анализ трансформации в отношении продуцирования интерферона.

Полученными плазмидами трансф.ор- мируют штамм Е.coli ИВ 101. Примерно 20% полученных трансформантов имеют вс тавки, из которых многие исследуются на эксп рессию интерферона. Для это- о 100 мл бактериальной культуры в М9 минимальной среде,, в которую до41

т .

. - , -

10

15

20

30

35

40

45

50

55

780012

бавлены все аминокислоты, кроме триптофана (20 мкг/м,п на аминокислоту), а также тиамин (1 мкг/мл),- глюкоза (0,2%) и индуктор триптофаноноперона индол-(3)-акриловая кислота (IAA, 20 мкг/мл, вьфащивают до оптической

плотности 0,6-0,8.- Бактерии пеллети- руют благодаря центрифугированию в течение 10. мин при числе оборотов 7000 в 1 мин, промывают 1 раз 50 мп трис-HCl, рН 8, 30 мкмоль NaCL и суспендируют в 1,5 мл такого же буфера. После инкубации с 1 мг/мл лизозима в течение 30 мин на льду бактерии пять раз замораживают и оттаивают и затем удаляют фрагменты клеток путем центрифугирования в течение 1 ч при 40000.об/мин. Надосадочную жидкость стерильно отфильтровыватот и испытывают в тесте по уменьшению пятен с

, 73-клетками и вирусом Vesicular, Stomatitis на интерферонную активность. Примерно половина всех клонов

25 (со вставками) обладает значительной инте-рферонной экспрессией: 2x10° единиц (международные стандартные единицы) на 1л культуры.

Выбирают один из этих продуцирующих интерферон клонов (pER 33) и от промотор-операторной области подвергают последовательному -анализу далее вплоть до интерфероногена, чтобы установить правильность сконструированного плазмида. Последовательный анализ с нова осуществляют по Махат и Gilbert от радиоактивно маркированного на З -конце Есо RI-сайта в .направлении интерферонгена.

Плазмида pER 103 содержит промотор- олераторную последовательность трип- тофаноперона Serratia marcescens в комбинации с синтетической последовательностью рибосомного связывания. Встроенные в плазмиду pER 103 пригод- ньтм образом гены показывают высокие значения экспрессии. Плазмида pER 103 штамм бактерий в E.coli К, ВВ 10.1 сдана на хранение в немецкое собрание микроорганизмов, GrisebachstraBe 8, 3400 Геттинген/ФРГ, под номером DSM 2773 от 27 октября 1983 г., согласно Будапештскому .договору.

Пр И мер 15. 2 мкг pER 33 разре- вают с помощью рестрикционной системы Есо RI и Вага HI, благодаря чему образуются два фрагмента длиной примерно 1300 Ьр и примерно 4000 bpi Эти фрагменты равделяют электрофоретиче.с1314

ки на 1,2%-ном агарозном геле. Более короткий, фрагмент выделяют из геля путем электроэлюирования. Концы этих ДНК благодаря добавке по 1,25 нмоль dATP, dGTP, dCTP и атТР, а также 2-х единиц Klenow-фрагмента ДНК-полимера зы 1 переводят в тупые концы. ДНК очищают путем экстракции фенолом и осаждения из этанольного раствора и затем растворяют- в 15 мкл HjO.

Примерно 15 пмоль Есо RI-линкера фосфорилируют по 5 -концам путем добавки у -р-АТР и Т4-полинуклеотид- киназы в 5 мл реакционного раствора. После инактивации нагреванием киназы добавляют 5 пмоль АТР и О,1 единицы Т4-лигазы и инкубируют 16 ч при 14°С Реакционный продукт очищают путем осаждения изопропанолом от низкомолекулярных веществ.

ДНК затем разрезают с помощью 20 единиц рестрикционного фермента Есо RI, еще раз -очищают путем осаждения изопропанолом и растворяйт в 10 мкл воды.

Примерно 2 мкг pER 33 обрабатывают :рестрикционным ферментом Есо RI. Затем добавляют щелочную фосфотазу, чтобы удалить 5 -фосфатные остатки длиной примерно 5300 Ьр, линейную ДНК путем электрофореза в 1, геле агарозы и электроэлюирования очищают от остаточной не разрезанной pER 33. ДНК экстрагируют фенолом и эфиром, осаждают из этанольного раствора и растворяют в 10 мкл воды.

4 мкл снабженного Есо RI-линкерами ДНК-фрагмента, который содержит IFNaA ген плюс регуляторные элементы лиги- руют друг с другом с 0,5 мкл обработанной Есо RI и дефосфорилированной pER-33 плазмидой в 20 мкл реакционного раствора с помощью 0,1 единицы Т4-лигазы. После инкубации в течение 16 ч при 14 С фермент разлагают путем нагревания при .

Escherichia coli НВ 101 трансформируют аналогично примеру 1. Два из таким образом полученных клонов испытывают аналогично примеру 2 на экспрессию интерферона посредством теста на уменьшение пятна. В то время как клон pER 33 содержит до 200 х 10 единиц IFN на 1 л культуры, с помощью одного из новых клонов pER 21/1 получают более чем 300 к 10 единиц на 1 л культуры.

0

Плазмиду pER 21/1 :выделяют в большом количестве и анализируют с помо- щью переваривания рестрикционными ферментами с помощью Hind III. Так

j.

как введенная в pER 33 вместо Есо RI ДНК имеет два идентичных Есо RI-сай- та, то возможны две ориентации этой ДНК и pER 21/1. Рестрикционное ферментное переваривание плазмиды pER 21/1 Hind III 21/1 с параллельно направленными интерферонгенами должно давать фрагменты примерной величины 4100, 950 (2 фрагмента) и 450 Ьр.

Когда оба ориентированы противоположно, размеры фрагментов следующие 4350, 950 (2 фрагментаэ.и 200 Ьр. Пе- реванивание примерно 2 мкг pER 21/1 с помощью рестрикционной системы Hind

III и последующий электрофорез в

1,4%-ном геле агарозы дают фрагменты примерной величины 4100, 950 и 450 Ьр, Поэтому оба IFNaA-гена ориентированы параллельно друг другу.

Пример 16. Примерно 200 пмоль Есо RI линкера (New England Biolabs. inc.) в 20 мкл реакционного раствора фосфорилируют на концах с помощью. 9 единиц Т4-полинуклеотидкиназы и

10 пмоль АТР, затем фермента, инакти- вируют при нагревании.

8 мкг плазмиды рРМ 31 разрезают с помощью эндонуклеазы Ava.1. Концы этой разрезанной плазмиды путем, добавки по 5 пмоль dATP, dGTP,,dTTP, а также 4 единиц фермента Klenow- фрагмента полимеразы 1 переводят в тупые концы.ДНК очищают путем экстракции фенолом и осаждения из этаг

нольного раствора и растворяют в 40 мкл воды.

Есо RI линкер вместе с .обладающей линеоризованными и тупыми концами ДНК в 70 мкл реакционного раствора с

б пмоль АТР и 1 единицей Т4-лигазы обрабатывают 16 ч при 14°С. После инактивации фермента при нагревании в растворе устанавливают рН 7,6 с помощью 50 ммоль NaCl и 50 мкмоль

трис-С1 и ДНК обрабатывают 300 единицами Есо RI. Спустя 2 ч времени инкубации рестрикционный фермент денатурируют при,нагревании и ДНК отделяют электрофоретически в 1,4%-ном

геле агарозы. Содержащий par-Lokus отрезок ДНК примерно длиной 400 Ьр электроэлюируют из геля, очищают путем экстракции фенолом и осаждения из этанольного раствора и растворяют

1) 50 MKJi воды. Этот отрезок ДНК имеет специфические выступы на своих концах Есо RI.

Примерно 2 мкг pER 33 обрабатывают с помощью рестрикциониого фермента Есо R1. Затем добавляют щелочную фосфата ЗУ, чтобы удалить 5 -фосфатные остатки. Линейную DNS длиной

5300 Vjp очИ1цают путем электроф.феза в 1,2%-ном геле аг ароэы и электроэлю- ирования от ocTiiTO4Horo не разрезанного pER 33.

ДНК-раствор экстрагируют фенолом и эфиром, осаждают из этанольного раствора и растворяют в 50 мкл воды.

1 мкл разрезанной плазмидной ДНК лигируют с 1 мкл par-Lokus ДНК в 20 мкл реакционного раствора с помощью 0,1 единицы Т4-лигазы. После инкубации в течение 16 ч при 14°С фермент инактивируют нагреванием. Escherichia coli НВ 101 трансформируют аналогично примеру 1. Получают примерно 50 колоний. Из 10 этих колоний выделяют незначительное количество шшзмида ДНК и разрезают с помощью рестрикционного фермента Pst 1. Из анализа путем электрофореза в агарозе следует, что все плазмиды содержат примерно 400 Ьр длиной par-Lokus. Выбирают один из этих плазмид и обозначают par pER 33.

Аналогично примеру 2 культивируют бактерии, которые содержат либо pER, либо par pER 33, и затем испытывают в тесте с уменьшением пятна на содержание интерферона. Оба штамма показывают примерно один и тот же уровень экспрессии интерферона.

В опыте, осуществляемом длительное время, который распространяется на 120 генераций бактерий, исследуют стабильность плазмидов рЕК 33 pER 33 и Escherichia coli НВ 101 в от- Ьутствии селекционного давления благодаря антибиотику ампициллину. В регулярные интервалы берут из культуры пробы и испытывают бактерии на содержание интерферона.

Из этого устанавливают, что pER 33 бактерии, содержащие pER 33, после примерно 60 генераций продуцируют интерферон. Бактерии, которые содержат par pER 33, продуцируют интерферон Л А спустя еще 120 генераций.

Таким образом, показано, что введение par-Lokus в pER 33 (par pER 33)

17800И

повышает стаби.аыюсть плазмиды в Escherichia col i Н15 101.

5

Формула изобретений

путем выделения промот ор-операторной области размером 90 Ьр из плазмиды pBR 101 в результате обработки фрагмента ДНК, кодирующего тринтофановый оперон Serratia marcescens раз-мером

5 1000 Ьр эндонуклеазами Есо RI 6-мера 5 -СААТТС и Нае III 4-мера 5 -GGCC, (Конструировании последовательности рибосомного связывания - RBS из трех синтетических олигонуклеотгщов

0 6-мера 5 -ТССТТА, 10-мера 5-. AGCTTAAACC и 12-мера 5 -TAAGGAGGTTTA, с последующим лигированием Есо RI- Нае Ill-фрагмента, кодирующего промотор-операторную область с последо5 вательностью рибосомного связывания и дальнейшим встраиванием промотор- операторного RBS-фрагмента в плазми- ду pBR 322 путем лигирования большого фрагмента Есо RI-Hind III разме0 ром 4332 Ьр с промотор-оператором- RBS-фрагментом, с последующей трансформацией бактерии Escherichia coli полученными рекомбинантными плазми- дами и отбором клонов, содержащих

плазмиду pBR 103, при этом структурный ген fff-интерферона получают в результате лигиров ания Ava II-фрагмен- та размером 646 Ьр из Pst 1-вставки клона 1F7 со смесью фрагментов разQ мером 34 Ьр и 143 Ьр, полученных в результате обработки Pst 1-вставки клона 1F7, эндонуклеазой Sau ЗА, фос- форилированием полученного фрагмента длиной 177 Ьр с последующей обработкой Ava II-эндонуклеазой и связыванием с олигонуклеотидным комплексом, сконструированным из синтетических олигонуклеотидов 14-мера 5- TGTGATCTGCCTCA, 12-мера 5 -AGCTTAAAGATG, 9-мера 5 -CAGATCACA и 8-мера 5- САТСТТТА, лигаты фосфорилируют и сшивают с 0,05 мкг Hind III, разрезанного и обработанного фосфотазой pER 103 с последующим трансформированием штамма бактерий E.coli НВ 101 полученными плазмидами и отбором клонов, содержащих конечную плазмиду.

0

5

171417800 8

ния стабильности плазмидЕЛ, плазмиду 3. Способ по п. 1,отличаюpER 33 обрабатывают Есо RI-эндонукле-щ и и с я тем, что, с целью повышеазой н щелочной фосфазой, фрагментния выхода (/-интерферона, концы Есо

размером 5300 Ьр связывают с par-Lo-RI-Bara Н1-фрагмента размером 1300 Ьр

kus, который получают путем лигирова-плазмиды pER 33 затупляют Klenow-фрагния Есо RI фосфорилированного линкерамента ДНК полимеразы I в присутствии

с 8 мкг плазмиды рРМ 31, предвари-dATP, dGTP, dCTP и dTTP и лигируют

телнир расщепленной Ava 1-эндонуклеа-с Есо RI фосфорилированным линкером,

ЗОЙ и затупленной с помощью фрагмента юполученный фрагмент встраивают в лиKlenow полимеразы I в присутствиинеаризированную плазмиду pER 33, обdATP, dGTP, dCTP и dTTP, полученной рабатьшают щелочной фосфатазой

рекомбинантной ДНК трансформируюти лигируют с вьщеленньм ранее

штамм E.coli НВ 101 и отбирают клоны,геном, содержащие плазмиду par pER 33.