Способ определения перекиси водорода при ферментативной реакции Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 

1133

Изобретение относится к биологической химии, в частности к определению перекиси водорода при ферментативной реакции.

Целью изобретения является повышение воспроизводимости способа за счет сохранения стабильности окрашенного комплекса.

Способ осуществляют следующим об.- разом.

К испытуемой пробе добавляют бу- ферньш раствор оксидазы, производное антипирина и фенольное соединение. С помощью фотометрии полученного окра- щенного комплекса определяют уровень перекиси водорода, образукяцейся в процессе ферментативной реакции. Согласно изобретению можно использовать обычные фенольные соединения, кото- рые могут сочетаться с 4-аминоанти- пирином с образованием красителя. Предпочтительным в качестве фенольно- го соединения является п-хлор)фенол. Примерами других подходящих соедине- НИИ является фенол, другие производные фенола, производные анилина, нафтол, производные нафтола, нафталин- амин, производные нафталинамина, ами- нохинолины, оксихинолины, диоксифе- нилуксусная кислота и т.п. Взаимодействие проводят в буферном растворе. В качестве буферного вещества и значения рН пригодны условия, известные в химии пероксидазы. Предпоч- тительны значения рН среды в интервале 6 - 9. В остальном выбор буфера и значение рН в случае реакции, включающей энзиматическое образование , обуславливается прежде всего требованиями, предъявляемыми к буферу и значению рН энзима, участвующего в реакции.

Пример 1. Определение образования HjOj при окисления глицерина с помощью глицериноксидазы.

.Приготавливают реагент 1:0,1 моль/ буфера тризтаноламина (НС1, рН 8,0, 3,6 ммоль/л или 2 г/л изотридецилово- го эфира, 4,7 ммоль/л или 2 г/л нат- рийхолата, 10 ммоль/л п-хлорфенола, 0,5 ммоль/л аминозамещенного 4-амино- антипирина, 10 Е/мл пероксидазы); реагент 2:500 Е/мл глицериноксидазы..

Для проведения определения 2 мл реагента 1 и 0,2 мл реагента 2 добавляют пипеткой в кювету. Экстинкцию EI, отсчитывают на потенциометре при 546 им. Непосредственно после этого

реакцюо начинают добавлением 20 мл пробы. Через 20 мин отсчитывают зкс- тинкцию Е. Температура инкубации составляет . Оценку проводят через калибровочную прямую, при которой измеренная разница экстинкций/1 Е Е/- - Е, стандартного раствора глицерина к концентрации глицерина находится в соотношении. Концентрации испытуемой смеси составляют 0,09 моль/л буфера триэтаноламина HCf; рН 8,0, 1,8 г/л (3,2 ммоль/л) изотридецилового эфира, 4,3 ммоль/л натрийхолата, 9ммоль/л п-хлорфенола, 0,45 ммоль/л аминозаме- щенного 4-аминоантипирина, 4 Е/мл пероксидазы, 45 Е/мл глицериноксидазы.

Пример 2. Исследована стабильность окраски пяти соединений. В качестве соединений для сравнения взяты 4-аминоантипирин и сульфированный 4-аминоантипирин. С этими сравнительными соединениями и новыми соединениями при использовании п-хлорфенола, 2,4-дихлорфенола и этилокситолуи- дина (сульфированного) в качестве фе- нольного компонента сочетания определяли ЭКСТИНКЦИЮ f , стабильность получающегося красителя и

При проведении испытания использовали следующие реагенты: реагент 1: О,1 моль/л фосфата калия в качестве буфера, рН 8,0, 0,1 ммоль/л производного 4-аминоантипирина, 1,0 ммоль/л фенольного компонента, 2 Е/мл ПОД; реагент 2: 0,01 моль/л раствора .

Условия определения: измерительное излучение 546 нм, толщина слоя кюве- гы 1 см, температура инкубации комнатная.

2,0 мл реагента 1 вносят в кювету пипеткой, добавляют 10 мкл реагента 2 (пробу) и смешивают. Экстинкцию проводят через 70 мин. Далее определяют контрольное значение. При этом вместо раствора к реагенту 1 добавляют буфер.

Результаты исследований приведены в таблице.

Процентные данные стабильности красителя (60 мин при комнатной температуре) относятся к отклонению, касающемуся измерительного сигнала, который возникает при появлении . Из таблицы видно, что на окс новые соединения изобретения оказывают лишь незначительное влияние, также и на значение экстинкции. Соединения согласно предлагаемому способу превосходят сравнительные соединения по стабильности окрашенного комплекса.

Формула изобретения

Способ определения перекиси водорода при ферментативной реакции, включающий взаимодействие пробы с буферным раствором оксидазы, добавление производного антипирина и феноль- ного соединения с последующим фото- метрированием окрашенного комплекса, отличают и йен тем, что, с

,

мкмоль/мл

500

502

505

IO+2Z

27+IX

505

507

33+16/J 32-1 1Z

36-21

макс

550

546550

Редактор Е.Копча Заказ 4151/59

Техред И.Попович

Кор Подп

Тираж 776 ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

целью повышения воспроизводимости способа за счет сохранения стабильности окрашенного комплекса, в качестве производного антипирина используют вещество, выбранное из группы: 4-аминоантипирин, 1-(С-этилами- нофенол-4-аминопиразолон-(5), 1- (амино-п-амино-толил)-2,З-диметил-4- аминопиразолон-(5), 1-(п-диэтил-ами- нофенил)-2,З-диметил-4-аминопиразо- лон-(5), в количестве О, 1-0, 5ммоль/л реакционной смеси.

I9t0120tOZI9 IZ

503

502

503

25-IZ

22+OZl5+2t 41+lZ

508

507

508

502

23-3Z

25-7125-5Z37- 1

548

546

550

546

Корректор В.Бутяга Подписное

Изобретение относится к биологической химии, точнее к определению перекиси водорода при ферментативной реакции. Цель изобретения - повышение воспроизводимости способа путем сохранения стабильности окрашенного комплекса. Дпя этого к испытуемой пробе добавляют буферный раствор ок- сидазы, производное антипирина и фе- нольное соединение. Фотометрически определяют уровень перекиси водорода протекающей ферментативной реакции. В качестве фенольного соединения, сочетающегося с 4-аминоантипирином, оптимален п-хлорфенол, фенол и другие его производные, производные анилина, нафтол и его производные, наф- талинамин и его производные, аминохи- нолин, оксихинолины и т.п. Взаимодействие проводят в буферном растворе с рН 6-9. 1 табл. I О) со со 00 00 см