Способ определения липазы Советский патент 1990 года по МПК G01N33/48 C12N9/20 

Йзобретение относится к аналитической химии и имеет огромное значение для клинической химии, биохимии, фармацевтической химии и химии пищевых продуктов.

Цель изобретения - повышение чувствительности определения.

. Изобретение предусматривает использование в качестве субстрата липазы соединение общей формулы

00

и ti HjC-Y-C-A-C-X

HC-Y-R

I

H C-Z-KI

где A - алкильная или алкиленовая группа с 2-12 атомами углерода;

о g

Ot) SI

ы

R и

R - одинаковые или разные, каждый означает алкильную группу с 6-18 атомами углерода, один из остатков R и R также атом водорода;

X - резоруфин, 6-метилрезоруфин, I,6-диметилрезоруфин, 8 этил- резоруфин, 8-бромрезоруфин; Y и Z - каждый независимо друг от друга означают -S- или

-О-, Z также -СН- , и оптическое определение по окраске количества освобожденного аромати- ческого гидроксильного или тиолово- го соединения непосредственно, или после сочетания с подходящим хромогеном.

Для R и R предпочитают алкильные группы в противоположность ацильным группам, так как они не чувствительны к гидролизу.

Примерами для R и/или R, являются остатки метила, этила, пропила, бутила, пентила, гексила, гептила, октила, нонила, деДила, ундецила, до децила, тетрадецила, гексадецила и октадецила как алкильные группы, а также соответствующие ацильные труп- пы, как грзшпы ацетила, пропионила, бутирила, валерила, капронила, кап- рила, капринила, лаурила, миристила, пальмитила и стеарила, олеила, крото- нила, линолила, фенила, бензила или октилфенила.

Далее предлагаемый субстрат липазы содержит остаток дикарбоновой кислоты СООН-А-СООН, в которой А имеет предпочтительно 3-7 С-атомов. Кислотами, образующими А, являются малоновая, янтарная, глутаровая, адипиновая, пимелиновая, пробковая азелаиновая, себациновая, нонандикар- боновая, декандикарбоновая к ундекан дикарбоновая кислоты. Предпочитают кислоты от глутаровой кислоты до азелаиновой кислоты, которые соответствуют А с 3-7 С-атомами.

X может быть ароматическим окси- или тиолсоединением, которое представ ляет хромофор или может быть переведено в красящее вещество лишь после- довате.пьной реакцией. Типичными при-. мерами являются фенол, тиофенол, нафтол, тионафтол и их производные,а также хромогенные соединения, как остаток резоруфина, 6-метилрезоруфин, | 4,б-дикетилрезоруфин, 1,6-диметилре-

Q

15

jQ

25 Q 35

5

зоруфин и 8-зтилрезоруфин, и 8-бромрезоруфин, хлорфенолового красного, индоксила или тиофлуоресцеина.

Предпочитают хромофоры, которые имеют небольшую полярность и являются жирорастворимь ми. Однако при этом должна быть.гарантирована еще водо- растворимость.

Жирорастворению названных хромофоров способствует подходящее замещение с алкильными группами, Так, для остатка резоруфина оказались группы метила, диметила и этила, а та1сже замещение с бромом.

Соединения по изобретению являются новыми. Они имеют асимметрический центр и поэтому оптически активны. В качестве субстрата липазы можно применять как образующиеся при, обычных методах получения рацематы, так и оптические изомеры.

Субстраты липаэы по изобретению можно получать известными методами.

Способ предусматривает использование в составе аналита реактива, предпочтительно содержащего, мг/мл: субст- рат 0,05-10, дезоксихолат 2-50, коли- паза 0,001-0,01, мочевина 1-100, NaCl 0,1-10, буфер 1-50, устанавливающие рН от 6 до 10,5 соответственно в пересчете на годный к употреблению раствор.

Приведенные примеры иллюстрируют как получение субстратов, так и способы определения липазы с их использованием

Пример 1. а) Сложный моноэфир 1,2-0-дигексил-рац-глицеро-З- глутаровой кислоты.

В раствор 3,3 г (11,5 ммоль) 1,2- О-дигексил-глицерина в 30 мл хлороформа добавляют последовательно 2,5 МП пиридина, на кончике шпателя 4-диметш1аминопиридин и 2,6 г (23 ммоль) ангидрида глутаровой гис- лоты. Смесь нагревают IО ч при флегме и после охлаждения разбавляют 200 мл хлороформа. Фазу хлороформа взбалтывают с J н. соляной кислотой и сушат. После отфильтровывания высушивающего вещества растворитель удаляют и остаток очищают на колонне с силикагелем (элюент: уксусный эфир - петролейный эфир 1:1).

ДС: Rf 0,45 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:2 + % ледяной уксусной кислоты).

Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0- дигексил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты.

Ь) 1,4 г (3,7 ммоль)раствора по способу 1а растворяют в 20 мл хлороформа и при охлаждении льдом закапывают 2 мл (23,3 ммоль) хлористого оксалила. Ледяную ванну удаляют и перемешивают раствор 12 ч при комнатной температуре. Затем сливают растворитель, остаток поглощают в толуоле и снова выпаривают. Полученное таким путем масло применяют без дальнейшей очистки.

с) О,8 г (3,7 ммоль) резоруфина суспендируют в 40 мл диметилформами- да при добавке 1,1 мл пиридина и на кончике шпателя 4-диметиламинопир дина. Туда закапывают раствор по способу 1Ь в 20 мл диметилформамида. После одно - и двухсуточного перемешивания при комнатной температуре фильтруют и сливают растворитель. Остаток поглощают в уксусном эфире, отфильтровывают нерастворимые компоненты и взбалтывают фильтрат с 1 н. соляной кислотой, затем с водой. После сушки органической фазы и отгонки растворителя получают маслянистый остаток, который очищают хроматографией на колонне с силикаге- лем (элюент: уксусный эфир - петро- лейный эфир 1:1)

ДС: Rf 0,70 (уксусный эфир - гексан 1:1).

Пример 2. а). Сложный моноэфир 1,2-0-диоктил-рац-глицеро-З- глутаровой кислоты.

Получение аналогично примеру 1а из 13 г (41 ммоль) 1,2 0-диоктил-гли церина, 150 мл хлороформа, 10 мл пиридина и 6,8 г (59,5 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты. Выход 6,5 г (37%).

ДС: Rf 0,31 (уксусный эфир - пе ролейный эфир 1:1).

Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0- диоктил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты.

b). Получение аналогично примеру Ib из 2 г (4,5 ммоль) по примеру 2а. с). 0,96 г (4,5 ммоль) резоруфина растворяют в 50 мл хлороформа при добавке 0,75 мл (5 ммоль) 1,8-диаза- бицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена и 0,1 г 4-диметиламинопиридина. Туда закапывают раствор по примеру 2Ь в 20 мл хлороформа. После одно- и двухднев04167

- 10

ного перемешивания при комнатной температуре фильтруют и удаляют растворитель. Переработка аналогична примеру 1с.

ДС: Rf 0,66 (уксусньп эфир гексан 1:1).

Примерз, а). Сложный моноэфир 1,2-0-диоктил-рац-глицеро-З-пи- мелиновой кислоты.

Получение аналогично примеру 1а из 3,2 г (10 ммоль) 1,2-0-диоктил- глицерина и 2,1 г (15 ммоль) ангидрида пимелиновой кислоты.

ДС: Rf 0,61 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:1).

IR (см-):(пленка):1740; 1710.

Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0- диоктил-рац-глицеро-3-пимелиновой

кислоты.

Ъ). Получение аналогично примеру 1Ь из 2,2 г (4,7 ммоль) За.

с). Получение аналогично примеру 2с из 1 г (4,7 ммоль) резоруфина, 25 0,7 мл 1,8-диазабицикло-(5,4.0)-ун- дец-7-ена и ЗЬ.

ДС: Rf 0,78 (уксусный эфир - гексан 1:2).

Пример4. а). Сложньй моноэфир 1,2-0-диоктил-рац-глицеро-З-азе- лаиновой кислоты.

15

20

30

0

5

Получение аналогично примеру 1а из 6,3 г (20 ммоль) 1,2-0-диоктил- глицерина, 80 мл хлороформа, 5 мл пиридина и 5,2 г (30 ммоль) ангидрида азелаиновой кислоты.

Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0- диоктил-рац-глицеро-3-азелаиновой

кислоты.

Ь). Получение аналогично примеру Ь из 3,2 г (6,5 ммоль) 4а и 3 мл хлористого оксалила.

с). Получение аналогично примеру 2с из 1,4 г (6,5 ммоль) резоруфина, 65 мл хлороформа, 1,1 мл 1,8- диазабицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена и 4Ь.

ДС: Rf 0,86 (уксусный эфир - гексан 1:2).

IR (см- ): (пленка) 1762; 1736.

Пример5. а). Сложный моноэфир 1,2-0-дидецил-рац-глицеро-З- глутаровой кислоты.

Получение аналогично примеру 1 а из 3,7 г (10 ммоль) 1,2-0-дидецил- глицерина, 40 мл хлороформа, 2,5 мл пиридина и 1,8 г (15,8 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.

0

5

ДС: Rf 0,77 (уксусньш эфир - гексан 1:2),

Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0 дидецил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты,

b). Получение аналогично примеру 1Ьиз 2,5 г (Зммоль) 5а, 50 мл хлорформа и 2,2 мл хлористого оксалила.

с). Попучение аналогично приме- ру 2с из 1,1 г (5 ммоль) резоруфи- на, 1 мл 1,8-диазабицикло-(5,4,0)- ундец-7-ена и 5Ь.

ДС: Rf 0,70 (уксусный эфир - гексан 1:1).

П р и м е р б. а). Сложный моноэфир 1,2-0 диундецил-рац-глицеро З- глутаровой кислоты.

Получение аналогично примеру 1а. из 2 г Г 5 ммоль ) 1,2-0-диундецш1- глицерина, 25 мл хлороформа, 1,4 мл пиридина и 0,9 г (7,5 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.

ДС: Rf 0,55 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:2).

IR (см ):(пленка) 1740; 1710.

Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0 диундецил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты.

Ь). Получение аналогично приме- pyjb из 2 г (3,9 ммоль) 6а 5 мл хлороформа и 1,8 хлористого оксалил

с). Получение аналогично примеру 2с из 0,83 г (3,9 ммоль) резору- фина, 0,61 мл 1,8-диазабицикло-(5,4 0)-ундец-7-ена и 6Ъ.

ДС: Rf 0,47 (RP 18, этанол - ацетон 2:1).

П р и м е р 7. а). Сложный моноэфир ,2-0 -дилаурШ1-рац-глицеро-3- глутаровой кислоты.

Получение аналогично примеру 1 а из 10,7 г (25 ммоль) 1,2-0-дилаурил- глицерина, 70 мл хлороформа, 5,5 пиридина и 3,3 г (29 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.

ДС: Rf 0,33 (уксусный эфир - перолейный эфир 1:1).

IR()(пленка): 1741; 1708.

Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0- дилаурил-рац-глидеро-З-глутаровой кислоты

Ь)„ Получение аналогично примеру 1Ь из 5,5 г (10 1чмоль) 7а, 50 мл хлороформа и 4,3мл хлористого оксалил

сТ Иолучение аналогично примеру 2с из 2,2 г (10 ммоль) резоруфина, 100 мл хлороформа и 1,5 ил 1,8-диaз бициклo-(5 94,0)-ундец-7-ена и 7Ь.

8

ДС: Rf 0,78 (уксусный эфир/петр лейный эфир 1:1).

IR (см-О(пленка): 1765; 1720.

П р и м е р 8. а). Сложный моноэфир 1,2-0-дилаурШ1-рац-глицеро-3- пимелиновой кислоты.

Получение аналогично примеру 1а и 8,6 г (20 ммоль) 1,2-0-дилаурил-гли- церина, 50 мл хлороформа, 15 мл пиридина и 4,3 г (30 ммоль) ангидрида пимелиновой кислоты.

ДС: Rf 0,5 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:2).

IR ()(пленка): 1740; 1710. Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0дилаурил-рац-глицеро-З-пимелиновойкислоты.

Ь). Получение аналогично примеру Ib из 1,66 г (3 ммоль) 8а и 1,3 мл хлористого оксалила.

с). Получение аналогично примеру 2с из 0,65 г (3 ммоль) резоруфина, 30 мл хлороформа, 0,5 мл 1,8-диаза- бицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена и &Ь.

ДС: Rf 0,75 (уксусный эфир - Iгексан 1:1).

IR (см- )(пленка): 1768; 1739.

П р им 8 р 9. а). Сложный моноэфир 1,2-0-дитетрадецш1-рац-глицеро- 3-глутаровой кислоты.

Получение аналогично примеру 1а из 14,6 г (30 .ммоль) 1,2-0-дитетра- децил-глицерина, 150 мл хлороформа, 8,2 мл пиридина и 5,1 г (45 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.

ДС: Rf 0,42 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:2).

IR ()(КВг): 1740;. 1710.

Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0- дитетрадецил-рац-глицеро-3-глутарово кислоты.

Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 3 г (5 ммоль) 9а и 2,2 мл хлористого оксалила.

с). Получение аналогично примеру 2с из 1,06 г (5 ммоль) резоруфина, 50 мл хлороформа, 0,75 мл 1,8-диаза- Iбицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена и 9Ь. ДС: Rf 0,34 (RP18, ацетонитрил дихлорметан 1:1).

IR (см ИкВг): 1763, 1735.

П р и м е р 10. а). Сложный моноэфир 1 ,2-0-дитетрадецнл-рац-глицеро3-пимелиновой кислоты .

Получение аналогично примеру 9а из 6,4 г (45 ммоль) ангидрида пимелиновой кислоты.

ДС: Rf 0,45 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:2).

IR ()(пленка): 1740; 1708.

Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0- дитетрадецил-рац-глицеро-З-пимелино- вой кислоты.

Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 3,1 г (5 ммоль) 10а и 2,2 мл хлористого оксалила.

с). Получение аналогично примеру 2с из 1,06 г (5 ммоль) резоруфи- на, 50 мл хлороформа и 0,78 мл 1,8- диазабицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена

и lOb,

ДС: Rf 0,71 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:2)

IR (см-)(пленка): 1755; 1734.

Пример 11. а). Сложный моноэфир 1,2-0-дигексадецил-8п-глицероглутаровой кислоты.

Получение аналогично примеру 1а из 2,7 г (5 ммоль) 1,2-0-дигек- садецил-Зп-глицерина, 50 мл хлорофома, 3 мл пиридина и 1,5 г (13 ммоль ангидрида глутаровой кислоты.

ДС: Rf 0,65 (уксусный эфир - петролейный эфир 151)

IR (см- )(КВг) :.1740; 1710.

Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0 дигексадецил-8п-глицеро-3-глутарово

кислоты.

Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 2,2 г (3,3 ммоль) Па и 1 мл хлористого оксалила.

с). Получение аналогично примеру 1с из 0,71 г (3,3 ммоль) резору- фина, 20 мл диметилформамида, 0,5 мл пиридина и ПЬ.

ДС: Rf 0,72 (уксусньш эфир - петролейный эфир 1:2).

Пример 12. а). Сложный моноэфир 1,2-0-дибензил-рац-глицеро-З- глутаровой кислоты

Получение аналогично примеру 1а из 3 г (11 ммоль) 1,2-0-дибензш1- глицерина, 30 мл хлороформа, 2,5 мл пиридина и 1,8 г (16 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.

ДС: Rf 0,39 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:Г+ 1% ледяной уксусной кислоты).t

Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0- дибензил-рац-глицеро-3-глутаровой

кислоты.

Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 2,9 г (7,5 ммоль 12а), 30 мп хлороформа и 3,3 мл хлористого оксалила.

5

0

5

с) . Получение аналогично примеру , 2с из 1,6 г (7,5 ммоль) резоруфииа, 75 МП хлороформа, 1,2 мл 1,8 диазаби- цикло-(5,4,0)-ундец-7-ена и 12Ь.

ДС: Rf 0,48 (уксусньш эфир - гексан 1:1).

Пример 13. а). Сложный моноэфир 1-0-октадещш-2-0-бензил-5п- глицеро-3-глутаровой кислоты.

Получение аналогично примеру 1а из 2,2 г (15 ммоль 1-0-октадецил-2- О-бензил-Зп-глицерина, 50 мл хлороформа, 3 МП пиридина и 1,5 г (13 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.

IR ()(пленка): 1730; 1700.

Сложный резоруфиновый эфир 1-0- октадецил-2-0-бензил-8п-глицеро-3глутаровой кислоты.

Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 1,7 г (3,1 ммоль) 1 За и 1,3 мл хлористого оксалила.

с). Получение аналогично примеру 1с из 0,8 г (37 ммоль) резоруфина, 20 мл диметилформамида, 0,7 мл пиридина и 1ЗЬ.

ДС: Rf 0,68 (уксусный эфир - петролейньш эЛир 1:1).

IR ()(КВг): 1768; 1739.

П р и м е р 14.а). Сложньш моно- . эфир 1,2-диоктаноил-5п-глицеро-3-глу- таровой кислоты.

Получение аналогично примеру 1а из 6,8 г (20 ммоль) 1,2-диоктаноил- , Sn-глицерина, 100 мл хлороформа, 12,5 мл пиридина и 5,8 г (50 ммоль) ан1:идрида глутаровой кислоты.

ДС: Rf 0,49 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:1).

Сложный резоруфиновый эфир 1,2- диоктанош1-8п-глицеро-3-глутаровой кислоты.

Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 2,2 г (5 ммоль) 14а и 2,2 мл д5 хлористого оксалила.

с). Получение аналогично примеру 1с из 1,05 г (5 ммоль) резоруфина, 30 мл диметилформамида, 0,75 мл пиридина и 14Ь.

ДС: Rf 0,86 (RP18, ацетонитрил - дихлорметан 1:2).

Пример 15. а). Сложный моноэфир 1,2-диолеил-рац-глицеро-З-глута- ровой кислоты.

Получение аналогично примеру 1а из 3,1 г (5.ммоль) диолеина, 40 мл хлороформа, 3 мл пиридина и 1,5 г (13 ммоль) ангидрида глутаровой кис- лоты.

0

40

50

55

11

ДС: Rf 0,32 (уксусный эфир - п ролейный эфир 1:1).

IR () (пленка): 1740; 1706. Диолеин можно получать в чистой форме из технического диолеина хроматографией на колонне с силикаге- лем при использовании уксусного эфира - петролейного эфира 1:3 в качестве растворителя.

Сложный резоруфиновый эфир 1,2- диолеил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты.

Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 3,5 г (4,8 ммоль) 15а и 1,3 м хлористого оксалила.

с). Получение аналогично примеру 1с иэ 0,9 г (4,2 ммоль) резоруфина, 20 мл диметилформамида, 1 мл пиридина 15Ь.

ДС: Rf 0,78 (уксусный эфир - петролейньй эфир 1:1).

Пример 16. Сложный нафтило- вый эфир 1,2-0-дитетрадецил-рац- глицеропимелиновой кислоты.

Получение осзпцествляют аналогично примеру 1 Ob и с из 0,72 г (5 ммоль) 1-нафтола. Очистка Flash- хроматографией на силикагеле с растворителем уксусным эфиром - гекса- ном 1I3.

ДС: Rf 0,89 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:5).

Пример 17. Сложный реэсруфи- новый эфир 1,2-диолеш1-рац-глидеро- 3-глутаровой кислоты.

10,3 г (14,2 ммоль) сложного мо- нозфира 1,2-диолеил-З-глицеро-глу- таровой кислоты по примеру 15а, 3,2 г (15 ммоль) резоруфина, 6,2 г (30 ммоль) дициклогексилкарбодиими- да и на кончике шпателя 4-диметил- аминопиридин перемешивают в 75 мл диметилформамида 2-3 дня при комнатной температуре. Затем разбавляют уксусным эфиром и осадок отфильтровывают. Фазу уксусного эфира взбалтывают с 1 н. соляной кислотой и сушат над сульфатом натрия. После отгонки растворителя остается маслянис тый остаток, который очищают хроматографией на колонне с силикагелем (растворитель:уксусный эфир - петролейный эфир 1:1).

Таким образом получают соответст- вующее производное хлорфенолового красного.

ДС: Rf 0,69 (RP18; изопропанол метанол 1:2).

)

041

0

15

20

25

30

,,

Q j л

5

6712

Пример 18. Получение сложного моноэфира 1,2-0-диоктил-З-пимелино- вой кислоты.

Стадия I:. синтез сложного бензило- вого моноэфира пимелиновой кислоты.

Стадия 2: аналогично примеру 1Ь из 2,5 г (10 ммоль) сложного бензи- лового эфира пимелиновой кислоты; полученное масло закапывают в раствор 3,2 г (10 ммоль) 1,2-0-диoктшl- глицepинa, 7 мл пиридина; обработка аналогично приме. 1с.

Стадия 3: указанный продукт растворяют в 20 мл тетрагидрофурана и после добавки 0,4 г палладия - активированного угля гидрируют. Сырой продукт очищают на колонне с силикагелем; растворитель уксусный эфир - петролейньй эфир 1:1.

ДС: Rf 0,61 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:1)

IR ( ) (пленка): 1740; 1710.

Пример 19. Синтез сложного моноэфира 1,2-диолеил-глицеро-3-глутаровой кислоты.

а). Сложный трихлорзтиловьш эфир 1,2-0-изопропилиден-глидеро-З-глута- ровой кислоты.

Стадия 1: 5,55 г (42 ммоль) изопро- пилиденглидерина и 12 г (45,3 ммоль) 2,2,2-трихлорэтш1-гидро-глутарата растворяют в простом диметиловом эфире этиленгликоля и смев1ивают с 10,5 г (51 ммоль)дидиклогексилкар- бодиимида, после двухдневного перемешивания фильтруют и подвергают перегонке; т.кип, ; (0,1 торр), бесцветное масло.

ДС: Rf 0,82 (адетон - хлороформ 1:1).

Стадия 2: полученное масло растворяют в П мл простого эфира, смешивают с 3 мл метанола и 3 мл 3 н. соляной кислоты и перемешивают 12 ч при комнатной температуре; органическую фазу встряхивают с нacьш eнным раствором бикарбоната натрия, затем с насыщенным раствором хлористого натрия и сзппат; после удаления растворителя остается маслянистый остаток.

ДС: Rf 0,23 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:1).

Ь). Сложный трихлорэтиловый эфир 1,2-диолеш1-глидеро-3-глутаровой кислоты.

Стадия 3: 6,1 г (18 ммоль) полученного продукта и 7,84 г (38 ммоль) олеиновой кислоты растворяют в

100 мл простого диметилового эфира ч этиленгликоля и закапывают раствор 10,5 г (37 ммоль)дициклогексилкар- бодиимида в 50 мл простого диметилового эфира этиленгликоля; после 12-часового перемешивания при комнатной температуре фильтруют и последовательно встряхивают с 3 н. соляной кислотой с раствором бикарбоната натрия, затем с водой. После сушки и концентрирования органической фазы остаток хроматсграфируют на силика- геле.

Стадия 4: слохньш моноэфир 1,2- диолеш1-глицеро-3-глутаровой кислоты отщепление защитной группы трихлор- этила осуществляют известным методом. .

П р и м е р 20. а). Сложный моноэфир I,2-0-дидецил-рац-глицеро-З- пимелиновой кислоты.

Получение аналогично примеру 1а из 5,6 г (15 ммоль) 1,2-0-дидецил- глицерина, 100 мл хлороформа, 3,2 мл .пиридина и 4,0 г (28 ммоль) ангидрида пимелиновой кислоты.

ДС: Rf 0,36 (уксусный эфир - гексан 1:1).

IR (см-)(пленка): 1735; 1710.

Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0- дидецил-рац-глидеро-3-пимелиновой кислоты.

Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 3 т (5,8 ммоль) 20а, 50 мл хлороформа и 2,2 мл хлористого оксалила

с). Получение аналогично примеру 2с из 1,1 г (5 ммоль) резоруфи- на, 1 мл (6,4 ммоль) 1,8-диазаби- цикло-(5,4,0)-ундец-7-ена и 20Ь.

ДС; Rf 0,71 (уксусный эфир - гексан 1:1).

IR (см - )(пленка): 1755; 1720.

П р и м е р 21. а). Сложный моно- эфир 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-З- азелаиновой кислоты.

;

.

10

15

-

604167

Получение аналогично примеру 1 а из 6,7 г (15,6 ммоль) 1,2-0-дилаурил- глицерина, 100 мл хлороформа, 3,2 мл пиридина и 4,0 г (23 ммоль) ангкдри- i да азелаиновой кислоты.

ДС: Rf 0,22 (уксусный эфир - гексан 1:1)

IR ()(пленка): 1738; 1710.

Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0- дилаурил-рац-глицеро-3-азелаиновой кислотыо

Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 1,5 г (2,5 ммоль) 21а 30 мл . хлороформа и 1,5 мл хлористого оксалила.

с). Получение аналогично примеру 2с из 0,55 г (2,5 ммоль) резоруфи- на, 25 мл хлороформа, 0,5 мл 20 (3,2 ммоль) 1,8-диaзaбициклo-(5,4,0)- yндeц-7-eнa и 21Ь.

ДС: Rf 0,78 (уксусный эфир - гексан 1:1).

IR () (пленка):, 1762; 1740.

П р и м е р 22. 60 мл дистиллированной воды растворяют при перемешивании 1. ,2 г дезоксихолата натрия и 0,15 мл колипазы (от свиньи). При сильном перемешивании впрыскивают туда по возможности тонкой струей 70 мг субстрата липазы сложного ре- зоруфинового эфира 1,2-0 -диоктил- рац-глицеро-3-азелаиновой кислоты (пример 4) в 1,7 мл п-пропанола при давлении. Раствор, который в 200 мл дистиллированной воды содержит в растворенном виде 1,5 г мочевины, 1 г дезоксихолата натрия, 200 мг хлористого натрия, 800 мг TRIS и 107 мг TRIS - НС1 буфера, хорошо смешивают с полученной Bbmie эмульсией.

2,5 мл изготовленного таким путем раствора смешивают с 100 мл пробы (сыворотка). Реакцию проводят при 578 мм рт.ст. с показаниями на фотометре.

При известной по стандарту активности липазы вычисляют активность липазы пробы следующим образом:

25

30

35

40

45

Изобретение относится к аналитической химии. Цель изобретения - повышение чувствительности. Способ определения липазы посредством воздействия на субстрат липазы с образованием хромогена предусматривает использование субстрата общей формулы X-CO-A-CO-Y-CH₂-CH(Y-R)-CH₂-Z-R₁, где A - алкильная или алкиленовая группа с 2 - 12 C-атомами, R и R₁, которые могут быть одинаковыми или разными, каждый обозначают алкильную группу с 6 - 18 C-атомами, один из остатков R и R₁ также обозначает атом водорода. X - резоруфин, 6-метилрезоруфин, 4,6-диметилрезоруфин, 1,6-диметилрезоруфин, 8-этилрезоруфин и 8-бромрезоруфин и каждый Y и Z, независимо друг от друга обозначают -S- или -О-, Z также обозначает -CH₂-. Количество освобожденного ароматического гидроксильного или тиолового соединения непосредственно или после сочетания с подходящим хромогеном оптически определяют по получившейся окраске. 3 табл.

активность

активность

Д Е/мин.

(пробы

активписмл/ V-U .-,,

,i Z§SB§2l2- iE ° b 2.

л .«г«

Д Е/мин

Вычисление активности липазы пробы возможно также по следующей формуле:

активность

(пробы)

(ед./1)

lOOO - V-n1kr ««V

Д Е/мин.

U

л .«г«

Д Е/мин

(стандарт)

где V

ges

5

- общий подъем испытывае- мой исходной смеси, см ;

I

гЗ.

V пробы- объем пробы, см ,

- коэффициент экстинкции

хромогена при 578 нм; d - толщина слоя кюветы,см;

АЕ/мин изменение экстинкции за 1 мин при 578 им.

При названных условиях реакции коэффициент экстинкции составляет 60,65 см.мкмоль

Пример 23. Для различных субстратов липазы определены изменения величины холостого опыта, чувствительность эстеразы и липазы и корреляция к нефелометрическому тесту с помутнением.

Изменение величины холостого опыта определено с реактивом по примеру 1 и различными субстратами липазы Вместо пробы добавляли 100 мл воды и наблюдали по фотометру изменение зкстинкции при 578 (мЕ/мин).

Дпя определения чувствительности эстеразы добавляли вместо пробы 100 мл карбоксилэстеразы (ЕС 3.1.1.1 около 20000 ед/л Берингер Маннхайм ГмбХ, номер определения 10 46 98) и наблюдали, как описано вьше, изменние экстинкциио

Для определения чувствительности липазы вместо пробы добавляли 100 мл липазы (ЕС 3.1.1.3, около 100 ед/л., Берингер Маннхайм ГмбХ, номер определения .41 45 90) и наблюдали, как описано вьше, изменение экстинкции,

Для определения корреляции к фелометрическому тесту с помутнением проводили с возрастающими количествами липазы (0-1000 ед/л) тест с помутнением (Берингер Маннхайм ГмбХ, номер определения 26 23 58), сравнивали с цветным тестом по примеру 22 и определяли коэффициент корреляции,.

Результаты показаны в табл.1.

При мер 24. 8,5 г дезоксихола та натрия, 0,05 г колипазы, 20 г ман нита, 0,05 г хлористого кальция , Оэ82 г хлористого натрия, 2,7 г TRIS и 0,4 г TRIS-HC1 растворяют в 200 мл дистиллированной воды. При перемешивании впрыскивают раствор, который содержит в растворенной форме 0,35 г сложного нафтолового эфира 1,2-0 ДИтетрадецш1-рац-глицеро-3- пимелиновой кислоты в 7 мл пропано- ла. Полученную таким путем эмульсию замораживают при -40°С и подвергают лиофилизации.

70 г полученного лиофилизата растворяют в 2 мл дистиллированной воды

0

5

0

5

0

5

0

5

и смешивают с 100 мл TR-раствора красного паранитроанилина (красный паранитроанилин-4-хлор-З-метилбен- золдиазоний-нафталин-1,5-дисульфо- нат) (231 мг в 10 мл дистиллированной воды).

После добавки 100 мл сыворотки наблюдают за реакцией при 405 нм по фотометру с

Определение концентрации липазы проводят по калибровочной кривой аналогично примеру 22.

Пример 25. В раствор 3,04 г тауродезоксихолата, 2,7 г поливоска 4000, 7 мг хлористого кальция, 0,2 мг колипазы (от свиньи) в 120 дистиллированной воды впрыскивают при перемешивании 150 мг субстрата липазы сложного резоруфинового эфира 1,2-0- дидецил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты в 3,5 мл п-пропанола.

К полученной таким путем эмульсии добавляют следую ций раствор и хорошо смешивают

10 г тауродезоксихолата, 6,4 г поливоска, 50 г маннита, 14 г мочевины, 800 мг хлористого натрия и 15 г ТР.ИС растворяют в 300 мл дистиллированной воды. При помощи раствора ной кислоты устанавливают рН 7,5 о После этого раствор дополняют до 400 мл дистиллированной водой.

2,5 мл полученной таким путем реакционной смеси смешивают с 100 мл сыворотки. Реакцию наблюдают при 578 нм по фотометру.

Оценку проводят, как в примере 22.

П р и м е р 26. В раствор 3,04 г тауродезоксихолата, 2,7 г поливоска 4000, 7 мг хлористого кальция, 0,2 мг колипазы (от свиньи) в 120 мл дистиллированной воды впрыскивают при перемешивании 150 мг субстрата липазы сложного резоруфинового эфира 1,2-0-дидецил-рац-глицеро-З-глу- таровой кислоты в 3,5 мл п-пропанола.

К полученной таким путем эмуль- сии добавляют и хорошо перемешивают следующий раствор.

10 г тауродезоксихолата, 6,4 поливоска, 50 г маннита, 14 г мочевины, 800 мг хлористого натрия, 28 г буфер- ного раствора CHES в 300 мл дистиллированной воды. При помощи раствора соляной кислоты устанавливают рН 8,5. После этого дополняют раствор до 400 мл дистиллированной водой.

1716041

2,5 мл полученной таким путем реакционной смеси смешивают с 100 мл сыворотки. Реакцию наблюдают при 578 им по фотометру.

Оценку производят, как указано в примере 22.

П р и м е р 27, В раствор из 4,0 г тауродезоксихолата Na, 0,06 г хлористого кальция, 0,2 мг колипазы (от Q свиньи), 5,0 г маннита и 2,0 г поливоска 4000 в 100 мл дистиллированной воды впрыскивают при перемешивании 150 мл сложного нафтолового эфира 1,2-0-дитетрадецш1-рац-глицеро-3-пи- 5 мелиновой кислоты, который растворен в 4 мл п-пропанола. При хорошем охлаждении полученную таким путем эмульсию обрабатывают несколько минут ультразвуком 20

Второй раствор содержит в 100 мл 2,4 г тауродезоксихолата Na, 2,0 г TRIS, 12,0 г маннита, 3,5 г мочевины и 0,5 г хлористого натрия. При помо- пщ соляной кислоты устанавливают рН 25 8,3.

Третий раствор содержит 1 г красного паранитроаналина TR (красный па- ранитроаналин TR 4-хлор-метил-бензол-, диазоний-нафталин-1,5-дисульфонат) в ЗО 40 мл дистиллированной зоды в растворенной форме,

5 ч. раствора 1 и 6 ч. раствора 2 смешивают с I ч. раствора 3. Полученным раствором пропитывают пригодную для получения тест-полоски всасывающую бумагу, например, сорта, VS532 фирмы Шляйхер унд Шулл и о сто- рожно сушат в камерной сушилке с цир- куляцией воздуха при температуре от 30 до 654.

До дальнейшего применения рекомендуется хранение в присутствии средства дегидратации.

35

Для испытания на липазу сыворотк

небольшое количество (несколько капель) ее наносят на полоску.

На основании кривой окрашивания в желтый цвет по времени можно еде- лать вывод об активности липазы исследуемой пробы,

П р и м е р 28. а). Сложный моноэфир 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-З- тетрадекандикислоты.

Получение аналогично примеру 1а из 8,6 г (20 ммоль) 1,2-0-дилаурил-. глицерина, 100 мл хлороформа, 4 мл пиридина, 0,4 г диметиламинопириди

Q 5 0

5

О

5

5

на, 9,6 г (40 ммоль) ангидрида двухосновной тетрадекановой кислоты.

ДС: R 0,45 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:5).

Сложный (6-метилрезоруфиновый) эфир 1,2-0-дилаурип-рац-глицеро-З- тетрадекановой дикислоты.

Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 3,35 г (5 ммоль) 28а и 2,2 мл хлористого оксалила.

с). Получение аналогично примеру 2с из 1,2 г (5 ммоль) 4-метш1резору- фина, 20 мл хлороформа, 0,75 мл 1,8- диазабицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена, 0,1 г диметиламинопиридина и 28Ь. ДС: R 0,63 (уксусный эфир - гексал 1:4).

d). Получают эмульсию, как указано в примере 22„ Однако вместо названного субстрата липазы применяют раствор 70 мг субстрата липазы сложного (6-метилрезоруфинового) эфира 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-З-тетра- декановой дикислоты, растворенного в 1,7 мл п-пропанола.

При этом получены следукщие тест- специфические параметры (ср. пример 23 и табл.1): величина холостого опыта 0,2 мЕ/мин; активность эстеразы 0,7 мЕ/мин; чyвcтвитeльнofeть липазы 23,6 мЕ/мин на 100 ед/л; коэффициент корреляции 0,09509.

П р и м е р 29. Сложный (6-метил- резоруфиновый) эфир 1,2-0-дш1аурил- рац-глицеро-3-глутаровой кислоты,

а). Получение аналогично примерам 7d,-c 2,3 г (10 ммоль). 4-метш1резо - руфина.

ДС: R, 0,68 (уксусный эфир - гексан 1:2).

Ь). Б 60 мл дистиллированной воды растворяют при перемешивании 0,9 г тауродезоксихолата натрия и 0,3 г кол1тазы (от свиньи). При хорошем перемешивании впрыскивают туда раствор сложного (6-метилрезоруфинового) эфира 1,2-0-дилаурил-рац-гл1щеро-3-глу- таровой кислоты, 70 мг в 1,7 мл п- пропанола. Затем добавляют.раствор (200 мл), которьй содержит в 200 мл 0,5 г мочевины, 1 г тауродезоксихолата натрия, 200 мл хлористого натрия и 2,9 г TRIS и устанавливают его величину рН до 7,5. После хорошего перемешивания 2,5 мл полученного таким путем раствора смешивают с 100 мл пробы (сыворотка). Реакцию наблюдают при 578 нм рт.ст. по фото19оценку,

16 как указаметру, производят

но в примере 22,

Тестоспецифические параметры (ср. пример 23 и табл.1): величина холостого опыта П,4 мЕ/мин; чувствительность липазы 28 мЕ/мин на 100 мЕ/мин; коэффициент корреляции 0,988.

Пример 30. 4-Метилрезоруфин. Получают из 7,5 г 2-метш1-4-нитро- зорезорцина, 4,2 г резорцина, 3,6 г пиролюзита, 4,3 МП серной кислоты, 75 мл метанола, 4 г цинкового порошка и 18 мл 25%-ного аммиака.

ДС: R, 0,70 (этанол - ацетон 2:1).

UY/YIS (0,1 М буферный раствор фосфата калия, рН 8,5),(о,кс 579 нм.

2-Метил-нитрозорезорцин получают по немецкому патенту 23 11 574, AI.

Пример 31. Сложньй (4-метил- умбиллифериловьй) эфир 1,2-0-дш1ау- p IЛ-paц-глицepo-3-глyтapoвoй кислоты,

а). 2,75 г (5 ммоль) 7а и 1 г (5 ммоль) 4-метилумбеллиферона раст- воряюТ в 30 мл тетрагидрофурана и затем добавляют 2 г (10 ммоль) ди- циклогексилкарбодиимида и 0,15 г диметиламино-пиридина. После 24-часо- вого перемешивания при комнатной температуре фильтруют и сгущают. Сырой продукт очип ают Flash-хроматографией .

ДС: R 0,40 (уксусньй эфир - петролейный эфир 1:3).

Ь). Эмульсию получают, как указано в примере 22, но вместо использованного там субстрата липазы применяют 35 мг сложного (4-метилумбеллиферило- вого) эфира 1,2-дш1аурил-рац-глицеро 3-глутаровой кислоты, растворенного в 1,7 мл п-пропанола о

Реакцию наблюдают по флуорометру при 25°С, а именно при длине волны возбуждения 364 нм, ширине щели 5 нм и длине волны излучения 448 нм и ширине щели 10 нмс

Тест-специфические параметры (ср пример 23 и табл.1): величина холостого опыта 0,4 мЕ/мин; чувствительность липазы 28 мЕ/мин на 100 единиц/л; коэффициент корреляции 0,9942

П р и м е р 32. Сложньй (р-нитро- тиофениловый) эфир 1,2-0-дилaVpил-paц- глицepo-3-rлyтapoвoй кислоты.

Получение 32 -Ь аналогично примерам 7а-Ъ.

5 О

5

0

20

с). Получение аналогично 1 с из 1,4 г (10 ммоль) р-нитротиофенола, 100 мл диметилформамида, 2,4 мл пиридина, 0,2 г диметиламинопиридина и 32Ь.

ДС: R 0,76 (уксусный эфир - гексан 1:4).

d) . В 27 МП дистиллированной воды растворяют при хорошем перемешивании следующие соединения: 4,83 мг. деоксихолата натрия; 28,00 мг CHES-2- (циклогексиламино)-этан-сульфокисло- та, 17,50 г мочевины, 2,13 мг хлористого натрия, 0,16 мг колипазы свиньи, 0,33 мг хлористого кальция, 152,00мг тауродезоксихолата натрия,

рН раствора 8,3. В этот раствор при хорошем перемешивании впрыскивают раствор сложного (р-нитротиофени- лового) эфира 1,2-0-дилаурил-рац-гли- церо-3-глутаровой кислоты. Затем раствор обрабатывали при охлаждении 2 мин ультразвуком (средней интенсивности) .

В 1 МП полученного таким путем эмульсионного раствора добавляли 50 мл пробы (содержащей липазу человеческой сыворотки) и смешивали. Реакцию наблюдали при 405 нм рт.ст. по фотометру и проводили вычисление, как указано в примере 22.

Тестоспецифические параметры: величина холостого опыта 0,3 мЕ/мин; чувствительность липазы 12,2 мЕ/мин на 100 ед/л; коэффициент корреляции 0,998.

П р и м е р 33. а). Сложньй моноэфир 1-О-(2-метокси-октадецил)-2-0- метйл-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты.

Получение аналогично примеру 1а из 3 г (7,7 ммоль) 1-0-(2-метокси-окта- децил)-2-0-метил-глицерина, 25 мл хлороформа, 1,8 мл пиридина, 0,1 г диметиламинопиридина и 1,75 (15 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты. Выход 1,5 г (39%).

ДС: R, 0,68 (RP18, ацетон - этанол 1:2).

Сложньй (6-метилрезоруфиновьй) эфир 1-0-(2-метокси-октадецш1)-2-оме- тил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты.

Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 1,5 г (3 ммоль) ЗЗа и 1,5 мл хлористого оксалила.

с). Получение аналогично примеру 2с из 0,68 г (3 ммоль) 4-метилр г

1

зоруфина, 0,45 мл 1 ,8-диазабицикло(5,4,0)-ундец-7-ена и ЗЗЬ .

ДС: R 0,86 (уксусный эфир), d), Тест-эмульсию получают, как указано в примере 22, однако в качес ве субстрата липазы используют сложный (6-метил-резоруфиновый J эфир 1(2-метокси-октадецил)-2-0-метил-рац глицеро 3-глутаровой кислоты.

Спределение концентрации липазы производят через калибровочную прямую из двух стандартов различной концентрации липазы, при которой изменение экстинкции за 1 мин наносят относительно изменения экстинкции.

Величина холостого опыта 8,4 мЕ/ми чувствительность эстеразы 25,3 мЕ/ми чувстбительность липазы 19,0 мЕ/мин на 100 ед/л; коэффициент корреляции 0,9483.

П р и м е р 34. а). Сложный моноэфир 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-З- янтарной кислоты.

Получение аналогично примеру 1а из 8,56 г (20 ммоль) I,2-0-дилаурШ1- глицерина, 4 г (40 ммоль) ангидрида янтарной кислоты, 60 мп хлороформа, 4,6 мл пиридина и 0,24 г диметилами- нопиридина. Продукт кристаллизуют из гексана. Т.пл. 41-43°С.

ДС: R, 0,26 (уксусный эфир - гексан 1:4).

Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0-

дилаурил-рац-глицеро-3-янтарной кислоты.

Ь). Получение аналогично примеру 17 из 2,65 г (5 ммоль) 34а, 1,06 г (5 ммоль) резоруфина, 6,18 г (30 ммол дициклогексилкарбодиимида, 0,1 г ди- метиламинопиридина и 50 мл диметил- формамида

ДС: R 0,47 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:3).

с). Получают эмульсию как указано в примере 22, однако в качестбе субстрата липазы в этом случае применяют 70 мг сложного резоруфинового эфира 1,2-0-дш1аурил-рац-глицеро-3- янтарной кислоты, растворенного в 1,7 мл п-пропанола.

При этом следующие тест- специфические параметры (ср,пример 23 и табл.1): величина холостого опыта 3,8-4,0 мЕ/мин; чувствительность эс- теразы не определена; чувствительность липазы 8,7 мЕ/мин на 100 ед/л; коэффициент корреляции 0,8793.

6722

П р и м е р 35. а). Сложный моноэфир 2-0-лаурил-октадекандиол (1,2)глутаровой кислоты.,

Получение аналогично примеру 1а из 4,6 г (10 ммоль) 2-0-лаурил-окта- декандиола (1,2), 29 мл хлороформа, 2,3 мл пиридина, 0,12 г диметлламино пиридина, 2,3 г (20 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.

ДС: R 0,54 (петролейный эфир - уксусный эфир 4:1)

Сложный (f-метилрезоруфиновый) эфир 2-0-лаурил-октадекандиол (1,2)глутаровой кислоты.

Ь). Получение аналогично примеру 1Ь.из 1,15 г (2 мноль) 35а и 0,88 мл хлористого рксалила.

с). Получение аналогично примеру 2с из 0,45 мл (2 ммоль) 4-метилрезо- руфина, 20 мл хлороформа, 0,3 мл 1,8-диазабицикло-(5,4,0)-ундец-7- ена, 40 мг диметиламинопиридина и 35Ь„

ДС: R, 0,37 (петролейный эфир - уксусный эфир 5:1).

d). Получают эмульсию, как указано в примере 22, однако в качестве субстрата липазы используют 70 мг сложного (б-метил-резоруфинового) эфира 2-0-лаурШ1-октадекандиол-1,2- 1-глутаровой кислоты растворенного .в 1,7 мл п-пропанолао

В соответствии с примером 23, табл.1 получают следующие тест-специфические параметры: величина холостого опыта 0,3-1,0 мЕ/мин; чувствительность эстеразы 1,0 мЕ/мин; чувствительность липазы 25,5 мЕ/минк хна 100 ед/ло, коэффициент корреляции 0,996с

П р и м е р 36„ а). Сложный моноэфир 1,2-0-дилаурил-рац-З-тиоглицеро- 3-глутаровой кислоты.

Получение аналогично примеру 1а из 2,5 г (4,8 ммоль)1,2-0-дилаурил- рац-З-тиоглицерина 14 мл хлороформа 1 МП. пиридина и 1,1 г (9,6 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.

ДС: RI 0,5 (гексан - тетрагидро- фуран 1:4).

Сложный (6-метилрезоруфиновый) эфир 1,2-0-дилаурш1-рац-3-тиоглице- ро-3-5-глутаровой кислоты.

Ь). Получение аналогично примеру 1Ь из 0s 74 г (1,3 ммоль) Зба и 0,6 мл хлористого оксалила.

с). Получение аналогично примеру 2с из 0,3 г (1,3 ммоль) 4-метилрезо23

руфина, 13 мл хлороформа, 0,2 мл

1,8-диазобицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена

27 мг диметиламинопиридина и ЗбЬ.

ДС: R 0,38 (петролейный эфир

уксусньш эфир 17:3).

Использованньй в качестве исходного вещества 1,2-0-дилаурил-рац-З- тиоглицерин получают известным способом следующим образом.

Превращение 1,2-0-дилаурилглицерина с хлорангидридом толуолсульфо- кислоты до дилаурил-глицеро-3-толуол сульфоната, затем реакция с тиомочев ной до соответствующей соли изотиоур ния, последующий гидролиз с соляной кислотой с

ДС: R 0,52 (петролейный эфир - уксусный эфир 49:1).

d). Получают эмульсию, как указано в примере 22. Однако вместо примененного там субстрата липазы используют раствор 70 мг сложного (б-метил резоруфинового) эфира 1,2-0-дш1аурил рац-3-тиоглицеро-3-5-глутаровой кислоты в 1,7 мл п-пропанола

Тестоспецифические параметры: величина холостого опыта 0,2 - 0,9 мЕ/мин; чувствительность эстара- зы 1,3 мЕ/мин; чувствительность ли- паз.ы 4,1 мЕ/мин на 100 ед/л., коэффициент корреляции 0,857.

П р и м е р 37. а). Сложный моноэфир 1,2-8-дилаурил-рац-1,2-дитио- глицеро-3-глутаровой кислоты.

Получение аналогично примеру 1а из 3 г (6,5 ммоль) 1,2-8-дилаурил- 1,2-дитиоглицерина, 30 мл пиридина и 1,5 г (13 ммоль) ангидрида глу- таровой кислоты.

ДС: Rf 0,43 (петролейный эфир - уксусный эфир 1:1).

ДС: Rf 0,37 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:4).

Сложный (6-метилрезоруфиновьш) эфир 1,2-8-дилаурил-рац-1,2-дитио- глицеро-3-глутаровой кислоты.

Ь). Ползгчение аналогично примеру 1Ь из 1,2 г (2 ммоль) 37а и 1 мл хлористого оксалила.

с). Получение аналогично примеру 2с из 0,46 г (2 ммоль) 4-метилрезо- руфина, 20 мл хлороформа, 0,3 мл 1, диазабицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена и 37Ь.

Примененный в качестве исходного вещества 1,2-8-дилаурил-рац-1,2-ди- тиоглицерин получают следующим образом.

24

В раствор 9 г (160 ммоль)гидроокиси калия в 250 мл этанола закапывают

0

5

10).

при комнатной температуре 10 г (80 ммоль) 2,3-димеркаптопропано- ла в 100 мл этанола. После одночасового перемешивания закапывают раствор 40 г (160 ммоль) додецилбромида в 100 мл этанола. Для дополнения реакции перемещивают еще два дня, затем фильтруют и фильтрат смешивают со льдом. После подкисления 2 н. соляной кислотой трижды экстрагируют простым эфиром, органическую фазу сушат и сгущают. Остаток очищают на колонне с силикагелем (растворитель: уксусный эфир - петролейный эфир 1: ДС: Rf 0,54 (уксусный эфир - петролейный эфир 1:10).

d). Получают эмульсию , как указано в примере 22. Вместо использованного там субстрата липазы применяют в этом случае сложный (6-метилрезоруфиновый) эфир 1,2-5-дш1аурил-рац-1,2-дитио- 5 глицеро-3-5-глутаровой кислоты, 70 мг, растворенные в 1,7 мл п-пропанола.

Холостой опыт 3 мЕ/мин; чувствительность эстеразы 3,4 мЕ/мин; чувствительность липазы 24 мЕ/мин; коэффициент корреляции 0,9943.

П р и м е р 38. 4,6-Диметилрезору- финовый эфир 1j 2-0-дилаурил-рац-гли- церо-3-глутаровой кислоты.

Указанное соединение получают аналогично примерам 7а-с, используя в качестве исходного материала 2,4 г (Ю ммоль) 4,6-диметилрезофурина. Тонкослойная хроматография: Rf 0,63 (смесь уксусноэтилового эфира и гексана в соотношении 1:2).

30

35

40

5

0

5

П р и м е р 39. 8-Бром-резоруфи- новый эфир 1,2-0-дилаурил-рац-глице- ро-3-глутаровой кислоты.

Указанное соединение получают аналогично примерам 7а-с, используя в качестве исходного материала 2,7 г (5 ммоль) 2-бромрезофурина.

Тонкослойная хроматография: Rf 0,6 (смесь уксусноэтилового эфира и гексана в соотношении 1:2)

П р и м е р 40. 8-Этш1резоруфино- вый эфир 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро- 3-глутаровой кислоты.

Указанное соединение получают аналогично примерам 7а-с, используя в качестве исходного материала 1,2 г (5 ммоль) 2-этилрезоруфина.

10

20

25

Тонкослойная хроматография: Rf 0,51 (смесь уксуснаэтилового эфира и петролейного эфира в соотнррении .1:3)

П р и м е р 41. 1-,6-Диметилреэору- финовый эфир 1,2-0-дилаурил-рац.-гли- церо-3-глутаровой кислоты.

Указанное соединение получают аналогично примерам 7а-с, используя в качестве исходного материала 1,2 (5 ммоль) 1,6 диметилрезоруфина.

Тонкослойная хроматография: Rf 0,73 (смесь уксусноэтилового и петролейного эфиров в соотношении 1:2),

П р и м е р 42. 4,6-Диметилрезору- jj фин.

Указанное соединение получают таким же образом, как Это описано в примере 30, используя в качестве исходных материалов 60 г 2-метил- 4-нитрсзорезорцина, 43,5 г 2-метил- резорцина, 34 г двуокиси марганца, 40 мл серной кислоты, 400 мл 25%-но- го раствора аммиака и 40 г цинковой пыли.

УФ/VIS . (О, 1 М калийфосфатный буфер с рН 8,5)(сс 585 нм.

П р им е р 43. 2-Бромрезоруфин.

Указанное соединение получают таким же образом, как это описано в примере 30, используя в качестве исходных материалов 19 г 4-бромрезор- цина, И г 4-нитрозорезорцина, 9,7 г двуокиси марганца, 11,5 мл серной КИСЛОТЫ, 115 мл 25%-ного раствора аммиака и 1,5 г цинковой пыли.

УФ/VIS (0,1 М калийнофосфатный буфер с рН 8,5),акс 576 нм.

П р и м е р 44. 2-Этилрезоруфин.

Указанное соединение ползгчают таким же образом, как это описано в примере 30, используя в качестве исходных материалов 5 г 4-ЗТИЛ-6-НИТ- розорезорцина, 3,3 г резорцина, 3 г двуокиси марганца, 3,4 мл серной кислоты, 50 мл 25%-ного раствора аммиака и 4 г цинковой пьши.

УФ/VIS (О,. М калийфосфатный буфер с рН 8,5); Л„о(Кс 573 нм.

П р и м е р 45. 1,6-Диметилрезору- фин.

Ука,занное соединение получают таким же образом, как это описано в . примере 30, используя в качестве исходных материалов 7,2 г 3,5-диокси- толуола, 7,7 г нитрозорезорцина, 4,9 г двуокиси марганца, 6,8 мл сер30

35

40

45

50

55

10

20

25

jj

30

ной кислоты, 60 мл 25%-ного раствора серной кислоты и 6 г цинковой пыли.

УФ/VIS (О,1 М калийфосфатный буфер с рН 8,5) ц.р 574 нм. Цветной тест на липазы (Р 2711.

Результаты определения активности липазы с замещенными резоруфино- вымк производными по примерам 38-41 представлены в табл.2.

Сравнение корреляции способа по изобретению и известного по Курсо- ка показано в табл.3.

I

Формула изобретения

Способ определения липазы, пре- дусматривающий взаимодействие знали- , та с субстратом липазы, приводящее к образованию хромогена, с последующим определением результата оптическим методом, отличающийся тем, что, с целью повышения чувстви- -тельности, в качестве субстрата используют грзшпу вег еств общей формулы

00

н 1}

HjC-y- C-A-C-X

где

35

40

45

50

HC-Y-R

I

HjC-z-Ki

R и R X 5

- алкИльная или алкилено- вая группы с 2-12 атомами углерода; одинаковые или различные, каждый обозначает алкильную группу с 6-18 атомами углерода, причем один из R и R обозначает водород;

резоруфин, б-метилрезору финовый остаток, 4,6-ди- метилрезоруфин, 1,6-ди- метилрезоруфин, 8-этидре : зоруфин и 8-бромрезору фин;

Уи Z - каждый независимо друг от друга означают -Sили -0-;

Z -CHji-,

а оптическим методом определяют количество высвобожденного гидроксиль- ного или тиолового соединегая непосредственно изда после сочетания с соответствующим хромогеном.

Корреляция с эталонным Способспособом (коэффициент

корреляции)

ТаблицаЗ