Способ определения активности химотрипсина или трипсина в кале Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 G01N33/68 

00

Изобретение относится к биохимии, точнее к медицинской энзимологии, предназначено для определения активности трипсина иди химотрипсина в кале при диагностике хронического nanjc- реатита. Цель изобретения - упрощение способа путем сокращения числа стадий. Дпя этого измеряют скорость расщепления пригодного субстрата суспензии кала в водной или водно-органической среде, кал суспендируют в присутствии поверхностно-активного вещества (ПАВ) в концентра1щи 0,1- 3 мас,% и водорастворимых солей с ионной силой 20-1000 ммоль/л, рН 7,0- 11,0. В качестве ПАВ используют, например, анионные или амфолитичес- кие (производные глицерина с бетаино- вой структурой, сульфобетаины, лецитины) ПАВ (алкенсульфонаты, олефино- вые сульфонаты, алкилнафталинсуль- фонаты, алкнлсульфаты, сульфаты: простых эфиров, жирных кислот, соли жирных и холевых кислот). Для фотометрического определения активности трипсина и химотрипсина целесообразно суспензию пробы центрифугировать перед измерением вплоть до осветления. 6 табл. СО

сн

Изобретение относится к биохимии., а именно к медицинской энзимологии, и может быть использовано для определения активности трипсина или хи- мотрипсина в кале, проводимого при диагностике хронического панкреатита Цель изобретения - упрощение способа за счет сокращения числа стадий.

Способ осуществляется следующим образом.

Определяют активность химот рип- сина или трипсина в кале путем измерения скорости расщепления пригодного субстрата суспензией кала в водной или водно-органической среде, при этом кал суспендируют в присутствии поверхностно-активного вещества в концентрации 0,1-3 мас.% и водорастворимых солей с ионной силой 20-1000 ммоль /л при рН 7,,0о

Измерение скорости расщепления субстрата можно осуществлять любым известным способом, например путем титрования вьщелившейся аминокислоты с помощью раствора щелочи на рН стате

В присутствии поверхностно-активного вещества солюбилизируется более 90 % ферментной активности, скорость реакции расщепления субстрата значительно повьшается, а кажущееся значение К для субстрата снижается (фактор активации равен 2-10)о Благодаря этому .можно также фотометрическим путем быстро, просто, точно и с незначительным расходом субстрата измерять его скорость расщепления В качестве поверхностно-активного средства можно использовать любое пригодное поверхностно-активное вещество, например анионные или амфо- литические поверхностно-активные вещества, предпочтительно неионогенные и особенно катионные поверхностно- активные вещества.

Анионные поверхностно-активные вещества представляют собой например, алкансульфонаты, олефиновые сульфонаты, в том числе куменсуль- фонат, сульфонаты сложных эфиров, ал киларилсульфонаты, алкилбензолсуль- фонаты типа додецилбензолсульфона- та и апкилнафталинсульфонаты; апкшт- сульфаты, в том числе лаурилсульфат натрия, сульфаты простых эфиров ипи сульфаты жирных спиртов, соли жирных кислот и холевых кислот. Амфо- литические поверхностно-активные вешества представляют собой таковые с . анионоактивными и катионоактивными гидрофильными группами, например произ водные глицерина с бетаиновой структурой, сульфобетаины и лецитины,Неионогенные поверхностно-активные вещества представляют собой, например, простые полиэфирыJ алкипфенолполи- гликолевые простые эфиры и другие продукты этоксилирования жирных кислот, амидов жирных кислот, жирных аминов и жирных спиртов, в том числе этоксилированньш лауриловьй спирт,

полимеры из пропилена с этипенокси- дом, полиоксиэтиленалкиловые простые эфиры или полиоксиэтиленнонштфенило- вые простые эфиры, полиоксиэтилен- сорбитан-моно-олеат или лаурат, про- дукты присоединения пропиленоксида с этилендиамином и этиленоксидом, окиси аминов и сложные эфиры жирных кислот многоатомных спиртов,полиглико- левые простые эфиры спирта, получаемого из сала.Катионные поверхностно- активные вещества представляют собой, например, линейные и циклические аммониевые соединения, в том числе чис-. К-цетил-К-этил-морфолинметосульфат,

бензальконийхлориды и другие четвер- тичные аммониевые соли, соли аминов, соли пиридиния или четвертичные (жир- ньй амин) - полигликолевые простые эфиры,

Выбор оптимального пригодного поверхностно-активного вещества зависит также от прочих реакционных условий, в особенности от рода фермента и субстрата, от рода и концентрации солей, а также от рН среды.

Из пригодных дпя предлагаемого способа катионных детергентов сильным активирзтощим эффектом обладают аммониевые соединения, предпочтительно формулы R,R,H (.,,, где R,- предпочтительно алкильный остаток с 9-14 С-атомами, главным образом лаурил и цетил; R.. - предпочтительно низший алкильньй остаток с 1-5 С-атомами или аралкильньй остаток, или оксиалкильньй остаток, особенно метил или бензил, а также алкшшириди- ниевые соли, предпочтительно с 12- 18 атомами углерода в алкипьном остатке, например лаурилпиридинийхлорид, лаурилпиридинийсульфат, особенно гек- садецилпиридинийхлорид. Особенно хорошо пригодным для предлагаемого способа поверхностно-активгазтм веществом является лаурил-триметил-аммо- нийхлорид.

Концентрация пробы кала в суспензии составляет 0,2-2 %.

Используемый для суспензии кала раствор для гомогенизирования наряду с поверхностно-активным средством содержит еще одну или несколько водорастворимых солей, например хлориды или сульфаты щелочных и/или ще- лочно-земельных металлов. Особенно целесообразно содержание NaCl 00- 1000 ммоль/л или CaClj 20 - 500 ммоль/л, или комбинация обеих солей в пределах указанных концентраций. Пригодны также органические соли, например ацетаты или цитраты, а также соли других катионов. Соли должны быть в концентрации, которая соответствует ионной силе 20 - 1000 ммоль/л. При этом установлено, что благодаря содержащему поверхностно-активное вещество и соли раствору для гомогенизирования происходит 25 испытуемой суспензии к 2 мл раство- сверхаддитивное увеличение активно- ра реактива) и титрометрически или

сти фермента (повышение скорости реакции), Т ое. увеличение, большее суммы величин, полученных в присутствии поверхностно-активного вещества или солей. Затем лишь с помощью комбинации соли С детергентом можно пе- ревести значительную часть связанного с частицами фермента трипсина или химотрипсина в раствор.

В качестве субстрата можно использовать любой известный субстрат для определения активности химотрипсина или трипсина в кале известными методами.

Для определения химотрипсина фотометрически особенно пригодным прежде всего в отношении водорастворимо- сти, стабильности, значения К (Vi и константы скорости оказался Аланил- аланил-фенилаланил-п-нитроанилид, особенно сук1щнил-аланш1-аланил-про- лил-фенилаланил-нитроанилид и МеО- сукцинил-аргинил-пролил-тирозил-п- нитроанилид. Хорошо: пригодным субстратом для определения активности трипсина является хромоцим TRY (карбобензокси-валил-глицил-аргинил- п-нитроанилид-ацетат).

Для приготовления раствора реактива субстрат растворяют в воде или в смеси воды с органическим растворителем. Органический растворитель при этом служит в качестве агента

фотометрически определяют скорость расщепления. При выборе количества и пытуемой суспензии (разбавление проб

30 кала) руководствуются достижением хо рошо измеримых значений, например, экстинкции/мин прежде всего в зависи мости от ожидаемой активности фермен та. На осн овании увеличения чувстви.jj- тельности за счет использования дете гента количество пробы может выбират ся настолько малым, что собственное поглощение суспендированного твердого вещества незначительно и таким

40 образом становится возможным фотомет рическое измерение в присутствии сус пензии. Рекомендуется добавление к растворам буферной смеси для установления значения рН 3-10, например,

45 трис-буфера, глицинового буфера или глиЦилглицинового буфера. Концентрация буфера составляет в общем 10- 1000 ммоль/л, оптимально 50 - 200 ммоль/л,

50

Измерение можно осуществлять вруч ную или с помощью автоматического анализатора. Для фотометрического определения активности и в особенно- gg сти для автоматического фотометричес кого измерения (определения экстинк- ции) целесообразно суспензию пробы центрифугировать перед измерением вплоть до осветления.

растворения для субстрата и представляет собой, например, ацетонитрил, диметилсульфоксид, ацетон или метанол. Раствор реактива содержит предпочтительно также еще те же соли, что используются для раствора при гомогенизации. Концентрация этих солей в растворе реактива в общем ниже концентрации в растворе для гомогенизирования. Общая концентрация солей составляет предпочтительно примерно 10 - 500 ммоль/л, например 250 ммоль/л хлорида натрия и

20 ммоль/л хлорида кальция.

Для проведения измерения определенное количество суспензии пробы кала в растворе для гомогенизирования или определенное количество полученного путем центрифугирования вплоть до осветления верхнего слоя жидкости после центрифугирования добавляют к определенному количеству раствора реактива (например, 0,1 мл

фотометрически определяют скорость расщепления. При выборе количества испытуемой суспензии (разбавление пробы

кала) руководствуются достижением хорошо измеримых значений, например, экстинкции/мин прежде всего в зависимости от ожидаемой активности фермента. На осн овании увеличения чувствительности за счет использования детергента количество пробы может выбираться настолько малым, что собственное поглощение суспендированного твердого вещества незначительно и таким

образом становится возможным фотометическое измерение в присутствии суспензии. Рекомендуется добавление к растворам буферной смеси для устаовления значения рН 3-10, например,

трис-буфера, глицинового буфера или глиЦилглицинового буфера. Концентраия буфера составляет в общем 10- 1000 ммоль/л, оптимально 50 - 00 ммоль/л,

Измерение можно осуществлять вручную или с помощью автоматического анализатора. Для фотометрического определения активности и в особенно- сти для автоматического фотометрического измерения (определения экстинк- ции) целесообразно суспензию пробы центрифугировать перед измерением вплоть до осветления.

Пример 1. Определение активности химотрипсина.

Раствор для гомогенизирования:

NaCl 2,9 г (500 ммоль/л)

CaClj 1,1 г (100 ммоль/л)

Лаурилтрнметиаммонийхпорид

(33%-ный) 2,0 г (0,7 %)

Дистиллиро

ванная

вода До 100 мл

Раствор реактива:

Сукцинил-аланилаланил-пролилфенилаланил-пнитроанилид 2 9,5 мг

(0,5 ммоль/л)

NaCl1,46 г

(250 ммоль/л)

CaClj222 мг

(20 ммоль/л)

Буфер трис-HCl,

рН 9,060 ммоль/л до

общего объема 100 мл

Гомогенизирование пробы.

Примерно 100 мг пробы кала смешивают со 100-кратным весовым количеством раствора для гомогенизирования и в пригодном сосуде гомогенизируют до высокодисперсной суспензии.

Осуществление измерения.

В спектрофотометрическую кювету с длиной оптического пути 1 см пипеткой вносят 2 мл раствора реактива, термостатитруют при 25°С и смешивают с 0,1 мл гомогената пробы. После кратковременного перемешивания определяют прирост зкстинкции в минуту при 405 нм. Для расчета активности фермента на 1 т кала прирост зкс- тшщик/мин при 405 нм нужно умножить на фактор 212.

I

Пример 2. Приготовление раствора для гомогенизирования и раствора реактива, а также гомогенизи- - рование пробы осуществляют по примеру 1. Затем суспензию центрифугируют до осветления раствора.Из верхней части жидкости после центрифугирования отбирают аликвотную часть и определяют активность фермента либо вручную (по примеру 1), либо при использовании автоматического анализатора.

678666

ПримерЗ. а Приготовление раствора для гомогенизирования.

Готовят водный раствор из следу- g ющих составных частей: трис-НС1-буфер,

рН 9,060 ммоль/л

NaCl250 ммоль/л

CaClj20 ммоль/л

10 Лаурил-триметиламмонийхлорид 0,6 % Приготовление раствора реактива, гомогенизирование пробы и осуществление измерения осуществляют соглас- 15 но примеру 1.

Полученные данные по активности химотрипсина в пробах кала представлены в табл.1.

Пример4. Приготовление раст- 20 вора для гомогенизирования аналогично примеру 1.

Приготовление раствора реактива. Водный раствор готовят из следзто- щих составных частей, ммоль/л -25 Аланил-аланилфенилаланш1-п-нит-роанилид2

NaCl250

CaCl,

20

60

трис-НС1-буфер,

рН 9

Гомогенизация пробы.

200 мг пробы кала смешивают с 10 мл раствора для гомогенизирования и обрабатывают в пригодном сосуде вплоть до образования высокодис- персной суспензии.

Осуществление измерения. В кювету с длиной оптического пути 1 см пипеткой вносят 1 мл раствора реактива, термостатируют при 25°С и смешивают с 0,02 мл гомогената пробы. После кратковременного перемеши- вания определяют прирост коэффициента экстинкции при 405 им Активность составляет 45 мЕд/мин.

Пример5. Приготовление раствора для гомогенизирования аналогич- но примеру 1.

Приготовление раствора реактива. Готовят водный раствор из следующих составных частей, ммоль/л:

3-Карбометоксипро- пионш1-1-аргинилЬ-пролил-Ь-тиро3ин-п-нитроанилид-гидро- хлорид 0,5

NaCl250

CaCIj20

трис-НС1-буфер,

рН 9,060

Гомогенизирование и измерение осу ществляют согласно примеру 1

Активность составляет 148 мЕд/мин

П р и м е р 6, Определение активности трипсина.

Раствор для гомогенизирования го товят аналогично примеру 1.

Приготовление раствора реактива

Готовят водный раствор из следующих составных частей, ммоль/л:

КарбобейзоксиЬ-валил-Ь-глицилL-аргинин-пнитроаннпид-ацетат 5

NaCl250

CaCl

г

20

50 г/л (5%) 500 ммоль/л 100 ммоль/л

трис-НС1-буфер,

рН 9,060

Гомогенизирование и измерение осуществляют согласно примеру 1.

Активность трипсина составляет 8 мЕд/мин.

Пример 7. Определение активности химотрипсина.

На фильтровальную бумагу наносят пробу кала, затем обрабатывают ее 0,05 .мл водного солюбилйзирующего раствора, состоящего из:

Лаурилтриметиламмонийхлорид

NaCl

CaClj

Затем фильтровальную бумагу обрабатывают 0,05 мл раствора реактива следующего состава:

Сукцинил-апанил- аланил-пролил-

фенилаланил-пнитроанилид

Н-с -Нафтилэтилендиамин

Нитрит натрия

Буфер трис-НС1,

рН 9,0

Спустя 5 мин на бумагу наносят 1 каплю трихлоруксусной кислоты (3,2 ммоль/л). В присутствии химо-. трипсина в пробе появляется интенсивное (фиолетовое окрашивание, величина которого зависит от количества фермента.

2 ммоль/л

г/л г/л

100 ммоль/л

8668

ПримерВ. Определение активности химотрипсина с различными детергентами при разных их концентрациях,

В табл.2 и 3 представлены данные по измерению активности химотрипсина в суспензии кала и супернатанте по примеру 1 при варьировании детергентов и их концентрации.

го- Ю

ю

П р и м е р 9. Определение активности химотрипсина при граничных значениях ионной сипы.

В табл.4 и 5 представлены данные 15 по ак тивности химотрипсина (при определении по примеру 1) при разных- значениях ионной силы.

Пример 10, Определение активности химотрипсина при разных значе- 20 киях рН,

В табл.6 представлены данные определения активности по примеру 1 при разных значениях рН.

25 Формула изобретения

Способ определения активности химотрипсина или трипсина в кале путем измерения скорости расщепления субстрата в присутствии суспензии кала в водной и водно-органической среде с последукицим определением продукта расщепления субстрата,о тличающий- с я тем, что, с целью упрощения способа за счет сокращения числа стадий, кал суспендируют в присутствии 0,1-3 мае.А поверхностно-активного вещества и водорастворимых солей с ионной силой 20-1000 ммоль/л, а определение ведут при рН 7,0-11,0.

Таблица 1

Проба

45

Активность химотрипсина, мЕд/мин

50

55

115120118

130130131

585760

606258

192019

21 2224

Таблица 3

Суспензия

Суспензия

Условия определения: в числителе - концентрация, а в знаменателе - ионная сида хлористого кальция, ммоль/л.

г

Таблица5

Условия определения: в числителе - концентрация, а

в знаменателе - ионная сила хлористого натрия, ммоль/л.

(Таблица 6

Буфер

Значение рН

35 36

49 52

Активность химотрипсина, мЕд/мин

Ацетат натрия

3,0

Трис-НС

6,0 17,0,0