1
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки рекомбинантного интерлей кина-2 (РИЛ-2) человека.
Целью изобретения является чения штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующего монокло-нальные антитела (МКА) к мембранному белку Е. coli м,м. 4 кВ, загрязняющему препараты РИЛ-2.
Штамм получают следующим образом
Мышей линии Bal b/c иммунизируют внутрибрюшинным введением 1500 ЕД РИЛ-2 человека в О,15 мл 0,15 М NaCl в смеси с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Иммунизации повторяют 3 раза через 14 дней тем же количеством антигена в смеси с не- полным адъювантом Фрейнда. За 3 дня до слияния Р1Ш-2 вводят внутрибрюшин но в 0,5 мл 0,15 М NaCl. Гибридизацию 1-10 клеток селезенки иммунных мышей и З Ю клеток миеломы мыши X63-Ag8-653 .проводят 50%-ным раствором полиэтиленгликоля мол.массы 4000, содержащего 5% диметилсульфок- сида, в течение 1,5 мин. После гибридизации и отмывки от полиэтилен- гликоля клетки высевают в 96-луноч- ные панели по 1-10 спленоцитов в лупку. Для культивирования и селекции гибридом используют среду 1МДМ (модифицированная Iskove s среда Дульбекко) с добавлением 10% эмбри- овальной телячьей сыворотки (ЭТО), гипоксантииа, 4-10 М аминоп- терипа и 1,6-10 М тимидина. Гибриды-продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений, высевая по 1 клетке в лунку, содержащую 4-10 клеток селезенки. После 2 клонирований практически 100% субклонов проду цируют МКЛ к антигену Е. coli.
Полученньй штамм обозначают 29БК25 он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных под номер ВСКК (П) 110 D и характеризуется слдующими признаками.
Культуральные признаки. Среда культивирования - среда 1МДМ с 10% донорской телячьей сыворотки, 2 мМ L-гЛютамина, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтапола, при 37 С и в атмосфере 5% COj..
«
t Q 5 Q
0
5
0
572
Для выращивания штамма используют стеклянную посуду; посевная доза 200 тыс. клеток на мл, клетки пассируют один раз в 2-3 дня, кратность рассева 1:6-1:8.
Культура суспензионная.
Культивирование в организме животных. -Для выращивания асцита пригодны мыши Balb/c, -Мышам за 7-30 дней до инъекции клеток штамма вводят внутри- брюшинно по 0,5 мл пристана. Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2-5-10 клеток в 1 мл среды 1МДМ. Асцит форми- мируется через 12-14 дней.
Продуктивность штамма. Секреция моноклональных антител на 2-3 день культивирования cocfaвляeт 35-40 мкг в 1 мл культуральной среды и 10-15 мг в 1 МП асцитной. жидкости при определении иммуноферментным методом.
Характеристика полезного продукта. Штамм -продуцирует моноклональные антитела изотипа IgGl. Специфичность - мембранный пептид Е. coli с мол.массой 4000, содержащийся в препарате РИЛ-2 человека. Методы оценки сохранения специфичности: тест на связыва- ние МКА с иммобилизованным частично очищенным РИЛ-2 (иммуноферментньй анализ). Продукция МКА сохраняется как минимум до 10 пассажей in vitro. В асцитной форме штамм не пассируется более одного раза.
Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено по характеру включения ти- мидиновой метки.
Криоконсервирование. Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10% диметил- сульфоксида. Режим замораживания: Ис в 1 мин до -70°С. После замораживания клетки переносят в жидкий . азот. Размораксивание - на водяной бане при +37°С. Жизнеспособность клеток после размораживания 40-50% по окрашив анию трипановым синим.
Пример I. Гибридомные клетки помещают в стеклянный флакон объемом 50 МП п о 1-10 клеток S 5 мл среды с 10% ЭТС, 2 мМ L-глютами- на, 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтанола (МЭ). Клетки культивируют 2-3 дня при З7 с в атмосфере 5% СО. Полученныи супернатант используют в ка- честре реагента в-иммунохимических реакциях (как препарат МКА),
Антигеиы высушивают в лунках 96-ячеечных микроплат при 37°С или 20 с в следующих количествах: частично очищенный РИ.П-2 - 150 нг в 20 мкл бидистиллированной воды; мембранная фракция, растворимые белки Е. со11 и бычий сывороточньй альбумин (БСА) по 1 мкг в 20 мкл бидистиллированной воды. После отмывок в ячейки вносят по 50 мкл культуральной среды штамма 29Б1.2, Панель инкубируют 2 ч при 20°С, затем отмывают 5 раз биистиллированной водой и вносят по 50 мкл/лунку кроличьи противомьшиные антитела, меченые пероксидазой, раз- веденной 1/2500 в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,4,.О,15 М NaCL, 1% БСА (ЗФР-БСА). После инкубации в течение 1 ч при 20 С плату отмывают и в лунки добавляют субстрат - ортофенилен- иамин гидрохлорид (0,6 мг/мл) в итратно-фосфатном буфере рН 4,7, содержащем 0,03% . Реакцию останавливают через 10 мин I М серной кислотой и учитывают на спектрофотоетре с вертикальным лучом при длине волны 492 нм.
Результаты исследований представены в таблице.
2083 420
1141 218
Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о высокой специфичности полученнь х МКА к мембранному белку Е. coli.
П р и М е р 2. Электрофорез в 15% -ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПЛАГЭ) проводят с использованием аппарату для вертикального элект- рофореза. РИЛ-2 в количестве 10 мкг в буфере для образца, содержащем или не содержащем МЭ (редуцирующие
0
5
0
5
и нередуцируюгцие условия), и эквивалентное количество лизата Е. cell в буфере для образца с МЭ прогревают 2 мин при 100 С и наносят в ячейки геля. Электрофорез осуществляют при постоянной силе тока 30 мА,
Электроперенос разделенных компонентов из геля на нитроцеллюлозу (НЦ) с диаметром пор 0,45 мкм проводят в течение 1 ч. После переноса ПЦ промывают дистиллированной водой и далее обрабатывают с помощью набора для иммуноблотинга. Неспецифическую сорбцию белка на НЦ блокируют в 0,02 М трис-НС буфере рН 7,4 с 0,5 М NaCl (ТБР), содержащем 3% желатины. После этого НЦ промывают 2 раза ТБР с 0,05% твин-20 (ТТБР) и разрезают на полоски. Полоски, соответствующие ДСН-ПААГЭ РИЛ-2 в редуцирующих и нередуцирующих условиях и лизата Е. coli, помещают в стеклянные пробирки емкостью 15 мл и добавляют 10 мл супернатанта MICA. 29Б1.2.
Инкубацию с МКА продолжают 2 ч при 20 С на аппарате с горизонтальным перемещиванием. После этого НЦ отмывают 3 раза по 5 мин ТТБР, добав ляют козьи антимышиные антитела, разведенные 1/2000 в ТТБР, 1% БСА и инкубируют 1 ч при 20 с с перемешиванием. После 2 отмывок ТТБР и одной-г отмывки ТБР реакцию проявляют в растворе субстрата, содержащем 4-хлор- -I-нафтол и 0,015% 112.0: в течение 20 мин. Для хранения и фотогрйфирова- НЦ промывают в дистиллированной воде и высушивают на воздухе.
Результаты исследований свидетельствуют о взаимодействии полученных антител с мембранным белком Е. coli м.м 4кВ, содержащимся в препарате с частично очищенного РИЛ-2 человека. Электрофоторетическая подвижность белка Е. coli при ДСН-ПААГЭ одинакова в редуцирующих и нередуцирумцих условиях. Полученные МКА используют для очистки РИЛ-2 человека. Содержание примесного белка Е. coli после очистки РИЛ-2 на сорбенте, содержащем полученные МКА, составляет 15%.
0
0
5
0
55
Формула изобретени
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Ми§ musculus ВСКК (П)М110 D, используемый для получе514461576
ПИЯ моноклональных антител к мембран- парате рекомбинаитного интерлейки- ному белку Escherichia coli в пре-на-2 человека.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки рекомбинантного интер- лейкина-2 человека. Целью изобретения является получение гибридных культивируемых клеток животных MUS musculus, продуцирующих мо- ноклональные антитела (МК) к мембранному белку Е. со11 4 кВ, содержащемуся в препарате части.чно очищенного рекомбинантного интерлейкина-2 (Р1-Ш-2) человека. Штамм получают гибрвдизацией спленоцитов мышей линии Balb/c, иммунизированных РИЛ-2 человека с клетками миеломы ХбЗ- -Ag8-653. Секреция МКА на 2-3 день культивирования составляет 35- 40 мкг/мл культуральной среды и 10- 15 мг/мл асцитической жидкости. МКА относятся к классу IgGi. Они специфически взаимодействуют с мембранным белком Е. coli м.м. 4кВ. Содержание примесного белка Е. coli после очистки РИЛ-2 на сорбенте, содержащем полученные МКА, составляет 15%. 1 табл. Ф
