Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый для получения моноклональных антител к липополисахариду ЕSснеRIснIа coLI Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определ ения антигена Escherichia coli в препаратах частично очищенно- го рекомбинантного интерлейкина-2 (РИЛ-2) человека, а также для его очистки.

Цель изобретения - получение гибп ридного штамма, продуцирующего моно- ; клональные антитела к липо юлисахариду E.coli.

.Штамм получают следугацим образом.

fclшeй линии Ва1в/с иммунизируют внутрибрюшинным введением 1500 ЕД Р ИЛ-2 человека в 0,15 мп 0,15 М NaCl в смеси с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Иммунизации повторяют 3 раза через 14 дней тем же ко- личест вом антигена в смеси с неполным адъювантом Фрейнда. За 3 дня до слияния Р ИЛ-2 вводят внутрибрюшинно в 0,5 МП 0,15 И NaCl. Гибридизацию 1x10 клеток селезенки иммунных мышей и 31(10 клеток миеломы мыши ХбЗ- §8-653 проводят 50%-ным раствором полиэтйленгликоля (молекулярной массы 4000), содержащего 5% диметилсуль- фоксида, в течение 1,5 iин. После гибридизации и отмывки клеток от no-:i лиэтиленгликоля, клетки высевают в 96-луночные панели по спленоци- тов в лунку. Для культивирования и селекции гибридом используют среду 1МДМ (модифицированная Isrove s Дульбекко) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 10 М гипоксантина, М аминс- птерина и 1,6 10 - М тимидина. Гибри- домы-продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений, высевая по 1 клетке в лунку, содержащую клеток селезенки. После 2 клонирова-t

1472497

лячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 00 мкг/мл пенидиллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтано ла, при 37 С и в атмосфере 57, СО2.

Культуральные свойства. Для выращивания штамма использовали стеклянную посуду, посевная доза - 200 тыс. клеток на миллилитр, клетки пассироний практически 100% субклонов проду- |Q вали один раз в 2-3 дня, кратность

цируют моноклональные антитела (МкАТ) к антигену E.coli. Продукция антитела сохраняется как минимум в течение 10 пассажей в культуре. Среда для культивирования - 1МДМ с 10% (ТС, 2 мМ 1-глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтанола при в атмосфере 5% углекислоты. Посевная доза 2 vlO клеток в

мл,

Через- 2-3 дня

перенося из жидкого азо- в водяную баню на 37°С.

концентрация антител в культуральной жидкости достигает 40-45 мкг/мл. Контаминация бактериями, грибками и микоплазмой не обнаружена. Для длительного хранения гибридомные клетки могут быть заморожены в ЭТС с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим замораживания: 1°С в минуту до , после замораживания клетки переносят в жидкий азот. Клетки размораживают, та

Для выращивания гибридомного штамма в асцитной форме клетки вводят внутрибрюшинно мышам Ва1в/с, обработанным пристаном, в количестве 2-5 х10 клеток на мыщь. Асцит созревает на 12-14 день.

Моноклональные антитела, продуцируемые клетками штамма ЗЗБ1.2, относятся к IgLI подклассу и связываются с липополисахаридом E.coli. Специфичность взаимодействия МкАТ с антигег: ном E.coli может быть выявлена спорассева - 1:6 - 1:8. Культура суспен зионная.

Культивирование в организме живот ных. Для выращивания асцита пригодны

15 мыши Ва1в/с. Мыщдм за 7-30 дней до инъекции клеток штамма вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристава. Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2- клеток в 1 мл среды IМДМ, Ас20 Цит формируется через 12-14 дней. Продуктивность штамма. Секреция моноклонального антитела (МкАТ) на 2-3 день культивир ования составляет 40-45 мкг в 1 мл культу25 ральной среды и 15-20 мг в 1 мл асцитной жидкости при определении им- муноферментным методом.

Характеристика полученного продук та. Штамм продуцирует моноклональное

30 антитело., с изотипом IgLI, Специфичность - антиген E,coli небелковой природы, .содержащийся в препарате Р ИЛ-2 человека. Методы оценки сохране ния специфичности: тест на связывание МкАТ с частично очищенным Р ИЛ-2 (иммуно-ферментный анализ).

Стабильность продукции. Продукция МкАТ сохраняется как минимум до 10 пассажей in vitro, В асцитной форме

40 штамм не-пассировался более одного раза,

Криоконсервирование, Для длительного хранения клетки штамма заморажи вают в эмбриональной телячьей сыво35

собом, при котором частично очищенный д ротке с добавлением 10% диметилсульф Р ИЛ-2 и белки E.coli (обработанные и оксида. Режим замораживания: в необработанные протеиназой К) исполь- -минуту до -70°С, После замораживания зуются в качестве антигенов (твердофазный иммуноферментный анализ).

50

Полученный штамм обозначают ЗЗБ1,-2, он хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АИ СССР под номером БСКК (II)IIID и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки. Стандартные условия культивирова- . ния: среда 1МДМ с 10% донорской теклетки переносят в жидкий азот. Размораживание - на водяной бане при +37 С, Жизнеспособность клеток после размораживания - 40-50% по окрашиванию трипановым синим, .

Контаминация, Бактерии и Грибы в 55 культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды, За:ражение микоплазмой не выявлено по характеру включения тими- диновой метки.

1472497

лячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 00 мкг/мл пенидиллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтано- ла, при 37 С и в атмосфере 57, СО2.

Культуральные свойства. Для выра. щивания штамма использовали стеклянную посуду, посевная доза - 200 тыс. клеток на миллилитр, клетки пассировали один раз в 2-3 дня, кратность

|Q вали один раз в 2-3 дня, кратность

рассева - 1:6 - 1:8. Культура суспен зионная.

Культивирование в организме животных. Для выращивания асцита пригодны

15 мыши Ва1в/с. Мыщдм за 7-30 дней до инъекции клеток штамма вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристава. Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2- клеток в 1 мл среды IМДМ, Ас0 Цит формируется через 12-14 дней. Продуктивность штамма. Секреция моноклонального антитела (МкАТ) на 2-3 день культивир ования составляет 40-45 мкг в 1 мл культу5 ральной среды и 15-20 мг в 1 мл асцитной жидкости при определении им- муноферментным методом.

Характеристика полученного продукта. Штамм продуцирует моноклональное

0 антитело., с изотипом IgLI, Специфичность - антиген E,coli небелковой природы, .содержащийся в препарате Р ИЛ-2 человека. Методы оценки сохранения специфичности: тест на связывание МкАТ с частично очищенным Р ИЛ-2 (иммуно-ферментный анализ).

Стабильность продукции. Продукция МкАТ сохраняется как минимум до 10 пассажей in vitro, В асцитной форме

0 штамм не-пассировался более одного раза,

Криоконсервирование, Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сыво5

ротке с добавлением 10% диметилсульф оксида. Режим замораживания: в -минуту до -70°С, После замораживания

ротке с добавлением 10% диметилсульф оксида. Режим замораживания: в -минуту до -70°С, После замораживания

клетки переносят в жидкий азот. Размораживание - на водяной бане при +37 С, Жизнеспособность клеток после размораживания - 40-50% по окрашиванию трипановым синим, .

Контаминация, Бактерии и Грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды, За:ражение микоплазмой не выявлено по характеру включения тими- диновой метки.

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Гибридомные клетки помещают в стеклянный флакон объемом 50 мл по клеток в 5 мл среды 1МДМ с 10% ЭТС, 2мМ L-глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтанола. Клетки культивируют 2-3 дня при 37°С в атмсфере 5% СО, Полученный супер- натант используют в качестве реагента в иммунохимических реакциях (как препарат МкАТ). Для проведения им- муноферментного анализа антигены вы-- сушивают в лунках 96-ячеечных микроплат при или в следующих количествах: частично очищенный Р ИЛ-2 - 150 нг в 20 мкл. бидистиллиро- ванной воды; мембранная фракция E.coli, бычий сывороточный альбумин (БСА), дрожжевой Т-РНК (ВДН) - по 1 мкг в 20 мкл бидистиллированной воды, протеиназа К - 0,5 мкг в 20 мкл бидистиллированной воды. Для выделения бактериальных липополисахаридов (ЛПС) частично очищенный Р ИЛ-2 и мем бранную фракцию E.coli обрабатывают протеиназой К (Пр К) в течение часа при 60°С. Депротеинизированные антигены в эквивалентном количестве с необработанными антигенами высушивают в лунках микроплаты из 20 мкл бидистиллированной воды. После отмывки в ячейки вносят по 50 мкл культу- ральной среды щтамма ЗЗБ1.2 или разведенных до концентрации 1 мкг/мл в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 1% БСА (ЗФР-БСА) МкАТ МАС-003, специфичных клеточному Ш1-2. Панель инкубируют 2 ч при 20°С затем отмывают бидистиллированной водой и вносят по 50 мкл/лунку кроличьи анти- мьшиные антитела, меченные пероксида- зой, разведенные 1/2500 в ЭФР-БСА. После инкуб.ации в течение 1 ч при 20 С плату отмывают и в лунки добав0

5

ляют ортофенилендиамин гидрохлорид 0,6 мг/мл в цитратнофосфатном буфере рН 4,7, содержащем 0,03% НгО. Реакцию останавливают через 10 мин 1 М серной кислотой и учитывают на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 492 нм.

Результаты опыта свидетельствуют о высокой специфичности МкАТ к липо- полисахариду E.coli, что позволяет использовать МкАТ для определения последнего в препаратах рекомбинант- ного ИЛ-2 человека.

Пример 2. 5мг сульфатной фракции асцита штамма ЗЗБ1.2 связывают с 1 мл CNBr - активированной сефаг розы На колонку наносят 0,5 мг частично очищенного Р ИЛ-2 в 8 мл

ЭФР .

Относительное содержание Р ИЛ-2,ли- пополисахарида Е. coli после сорбции определяют на основании данных иммунофер- ментного анализа с антигенами, иммоби- 5 лизованными на пластике (пример 1) .В ка- честве антигенов используют серийные разведения исходного образца Р ИЛ-2 и элюата, в качестве первых антител- МкАТ штамма 26Б1.2, реагирующие с Р ИЛ-2, и МкАТ щтамма ЗЗБ1.2.

Результаты опыта по удалению липо- полисахарида E.coli из препарата частично очищенного Р ИЛ-2 иммобилизованными антителами штамма ЗЗБ1.2 показывают, что содержание ЛПС E.coli в элюате менее 10%, а Р ИЛ-2 - 81%.

Эти данные свидетельствуют о возможности использования МкАТ штамма ЗЗБ1.2 для очистки Р ИЛ-2 человека.

0

0

5

Формула изобр етения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus BCKK(II) № 11 ID, используемый для получения моноклойальных антител к липополиса- хариду Escherichia coli.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения антигена ESCHERICHIA COLI в препаратах частично очищенного рекомбинантного интерлейкина - 2 (рил-2) человека, а также для его очистки. Цель изобретения - получение гибридного штамма, продуцирующего моноклональные антитела к липополисахариду E.COLI. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии BA1B/C, иммунизированных РИЛ-2 человека, с клетками миеломы X63-AG8-653. Клетки культивируют, и через 2-3 дня секреция МкАТ составляет 40-45 мкг/мл культуральной жидкости. МкАТ относятся к классу JGZ1, специфически взаимодействуют с липополисахаридом /ЛПС/ E.COLI. МкАТ могут быть использованы для определения ЛПС в препаратах частично очищенного РИЛ-2, а также его очистки от ЛПС.