Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS,используемый для получения моноклональных антител к мембранному белку ЕSснеRIснIа coLI в препарате рекомбинантного интерлейкина-2 человека Советский патент 1988 года по МПК C12N5/00 

с

05

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для.очистки рекомбинантного интер- лейкина- 2 (РШ1-2) человека. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к мембранному белку Е.соИ м.м. 45 кД, содержащемуся в препарате частично счищенного РИЛ-2 человека. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Balb/c, .иммунизированных РИЛ-2 человека, с клетками миеломы X63-Ag.B-653. Штамм продуцирует МКА в концентрации 25-30 мкг/мл культу- ральной среды и 10-12 мг/мл асцити- ческой жидкости. МКА относятся к классу IgGi. Они специфически взаимодействуют с мембранным белком E.coli 45 кД. Содержание примесного белка E.coli в РИЛ-2 человека после очистки на сорбенте, содержащем по- .лученные МКА, составляет 10%.1 табл. i (Л

сл

4

11А

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки рекомбинантного интерлейки- на-2 человека.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к мембранному белку E.col м.м, 45 кД, содержащемуся в препарате частично очищенного рексмбинантно го интерлейкина-2 (РИЛ-2) человека.

Штамм получают следующим образом,

Мышей линии Balb/c иммунизируют внутрибрюшинным введением 1500 ЕД РИЛ-2 человека в 0,15 мл 0,15 М NaCl в-смеси С равным объемом полного адьюванта Фрейнда, Иммунизации повторяют 3 раза через 14 дней тем же ко- личеством антигена в смеси с неполным адьювантом Фрейндаг За 3 дня до слияния РИЛ-2 вводят внутрибрюшинно 0,S мл 0,15 М NaCl, Гибридизацию 1x10 клеток селезенки иммунных мы- шей и 3x10 клеток миеломы мыши X63-Ag: .8-653 проводят 50%-ным раствором полиэтиленгликоля мол,массы 4000, содержащего 5% диметилсульфоксида, в течение 1,5 мин. После гибридиза- ции и отмывки клеток от полиэтилен- гликоля клетки высевают в 96-луноч- ные панели по 1x10 спленоцитов в . лунку. Для культивирования и сапе:кци гибридом, используют среду 1МДМ(мо- дифицированная Iskove s среда Дуль- бекко) с добавлением 10 эмбрионал - ной телячьей сыворотки (ЭТС), гипоксантина, 4x10 М аминоптерина и 1, тимидина, Ги6риды проду- центы клонируют 2 раза методом конечных разведений, высевая по 1 клетке в лунку, содержащую 4x10 клеток селезенки. После 2 клонирований практически 100% субклонов продуцируют МКА к антигену E,coli,

Наиболее продуктивный, штамм выводят в массовую культуру и обозначают 22А1,2, Штамм 22А1,2 хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоноч- ных Института Цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) N 112Д, и характеризуется следующими признаками,

Культуральные признаки. Среда культивирования - среда-ТМДМ с 10% донорской телячьей сыворотки, 2 мМ L-гнютамина, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05 мМ

с 0 5 0 д

5

5

542

меркаптоэтанола, при и в атмосфере 3% СО 7.

Для выращивания штамма используют стеклянную посуду, посевная доза 200 тыс. клеток на 1 мл клетки пассируют один раз в 2-3 дня, кратность рассева 1:6 , 1:8,

Культура суспензионная.

Культивирование в организме животных. Для выращивания асцита пригодны мыши Balb/c, Мышам за 7-30 дней до инъекции клеток штамма вводят внутрибрюшиннно по 0,5 мл пристана. Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2-540 клеток в 1 мл среды 1МДМ, Асцит формируется через 12-14 дней.

Продуктивность штамма. Секреция моноклональных антител на 2-3 день культивирования составляет 25-30 мкг в 1 мл культуральной среды и 10- 12 мг в 1 мл асцитной жидкости при определении иммуноферментным методом.

Характеристика полезного продукта. Штамм продуцирует моноклональные антитела изотипа IgGI. Специфичность - мембранный белок E,coli с мол,массой 45000, содержащийся в пре парате РИЛ-2 человека. Методы оценки сохранения специфичности; тест на связывание МКА с иммобилизованным частично очищенным РИЛ-2 (иммунофер- ментный анализ).

Продукция МКА- сохраняется как ми- )нимз до 10 пассажей in vitto, В асцитной форме штамм не пассируется более одного раза.

Контаминация, Бактерии и грибы в культуре 1(не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено по характеру включения тимидиновЪй метки,

Криоконсервирование, Для длительного хранения , клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим замораживания; 1 С в 1 мин до -70°С, После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание - на водяной бале при . Жизнеспособность клеток после размораживания 70-80% по окрашиванию трипановьм синим.

Пример 1, Гибридомные клетки помещают в стеклянный ф.пакон объемом 50 мл по 1x10 клеток в 5 мл среды 1МДМ с 10% ЭТС, 2 мМ ь-глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтанола (МЭ). Клетки культивируют 2-3 для при в атмосфере 5% СО. Полученный супер- натант используют в качестве реаген- g та в иммунохиьшческих реакциях (как препарат МКА),

Антигены высушивают в лунках 96-ячеечных микроплат при 37°С или 20 С в следующих количествах: частич- ю но очищенный РИЛ-2 (150 нг в 20 мкл бидистиллированной воды) мембранная фракция, растворимые белки E.coli и бычий сывороточный альбумин (ЕСА) - по 1 мкг в 20 мкл бидистиллированной 15 воды. После отмывок в ячейки вносят по 50 мкл культуральной среды штам- ма 22А1,2. Панель инкубируют 2 ч при , затем отмывают 5 раз бидистиллированной водой к вносят по 20 50 мкл/лунку кроличьи противомышиные антитела, меченые перок:сидазой, разведенные 1/2500 в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 1% БСА

сутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГЭ) проводят с использован ем аппарата для вертикального элек рофореза. 10 мкг РИЛ-2 в буфере дл образца, содержашем или не содержа Мэ (редуцирующие и нередуцирующие услопия) и эквивалентное количеств лизата E.coli в буфере для образца с Мэ I прогревают 2 мин при 100°С и наносят в ячейки геля. Электрофо рез осуществляют при постоянной си ле тока 50 мА.

Электроперенос разделенных комп нентов из геля на нитроцеллюлозу (НЦ)-с диаметром пор 0,45 мкм пров дят в течение 1 ч. После переноса промывают дистиллированной водой и далее обрабатывают с помощью набор для иммуноблотинга. Неспецефическу сорбцию белка на НЦ блокируют в 0,02 М трис-НС буфере рН 7,4 с 0,5 М NaCl (ТБР), содержащем 3% же латины. После этого НЦ промывают

(ЗФР-БСА). После инкубации в течение 25 2 раза ТБР с 0,05% твин-20 (ТТБР)

1 ч при 20°С плату отмывают и в лунки добавляют субстрат - ортофенилен- диамин гидрохлорид (0,6 мг/мл) в цитратно-фосфатном буфере рН.4,7, содержащем 0,09% ) о Реакцию оста- зо навливают через 10 мин Ш . серной кислотой и учитывают на спектофото- метре с вертикальным лучом при длине волны 492 нм.

Результаты исследований представлены в таблице

и разрезают на полоски. Полоски, соответствующие ДНС-ПААГЭ РИЛ-2 в редуцирующих и нередуцирующих усло виях и лизата E.coli, помещают в стеклянные пробирки емкостью 15 мл и добавляют 10 мл супернатанта ККА 22А1.2.

Инкубацию с ЖА продолжают 2 ч при 20°С на . аппарате с горизонтал ным перемешиванием. После этого НЦ

35 отмывают 3 раза по 5 мин ТТБР, одо бавляют козьи антимышиные антитела разведенные 1/2000 в ТТБР, 1% БСА и инкубируют 1 ч при 20°С с переме шиванием. После 2 отмывок ТТБР и о ной отмьшки ТБР реакцию проявляют в растворе субстрата, содержащем 4-хлор-1-нафтол и 0,015% , в т чение 20 мин. Для хранения и фотографирования НЦ промывают в дистил

Антигены

Культурапьная среда щтам- ма 22А1.2 А492, х 10

2143

509

1573

171

Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о высокой спе- 55 эффективно использованы для очистки

цифичности МКА полученного штамма к мембранному белку E.coli,

П р и М е р 2. Электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГЭ) проводят с использованием аппарата для вертикального электрофореза. 10 мкг РИЛ-2 в буфере для образца, содержашем или не содержаще Мэ (редуцирующие и нередуцирующие услопия) и эквивалентное количество лизата E.coli в буфере для образца с Мэ I прогревают 2 мин при 100°С и наносят в ячейки геля. Электрофорез осуществляют при постоянной силе тока 50 мА.

Электроперенос разделенных компонентов из геля на нитроцеллюлозу (НЦ)-с диаметром пор 0,45 мкм проводят в течение 1 ч. После переноса НЦ промывают дистиллированной водой и далее обрабатывают с помощью набора для иммуноблотинга. Неспецефическую сорбцию белка на НЦ блокируют в 0,02 М трис-НС буфере рН 7,4 с 0,5 М NaCl (ТБР), содержащем 3% желатины. После этого НЦ промывают

2 раза ТБР с 0,05% твин-20 (ТТБР)

и разрезают на полоски. Полоски, соответствующие ДНС-ПААГЭ РИЛ-2 в редуцирующих и нередуцирующих условиях и лизата E.coli, помещают в стеклянные пробирки емкостью 15 мл и добавляют 10 мл супернатанта ККА 22А1.2.

Инкубацию с ЖА продолжают 2 ч при 20°С на . аппарате с горизонтальным перемешиванием. После этого НЦ

отмывают 3 раза по 5 мин ТТБР, одо- бавляют козьи антимышиные антитела, разведенные 1/2000 в ТТБР, 1% БСА и инкубируют 1 ч при 20°С с перемешиванием. После 2 отмывок ТТБР и одной отмьшки ТБР реакцию проявляют в растворе субстрата, содержащем 4-хлор-1-нафтол и 0,015% , в течение 20 мин. Для хранения и фотографирования НЦ промывают в дистил-

лированной воде и высушивают на воз- ДУхе.

Результаты исследований свидетельствуют о взаимодействии полученных антител с белком E.coli с м.м, 45 кД. Электрофоретическая подвижность белка E.coli при ДСН-ПААГЭ одинакова в редуцирующих и нередуцирующих условиях. Полученные антитела могут быть

РИЛ-2 человека. Содержание примесного белка E.coli в РИЛ-2 человека после очистки на сорбенте, содержащем полученные МКА, составляет 10%.

5 1АА61546

Формул а и 3 о б р е т е н и я чения моноклонал1Л1ых антител к мемШтамм гибридных культивируемых бранному белку Escherichia coli в клеток животных Mus musculus ВСКК препарате рекомбинантного интерлей- (II) N 112D, используемый для полу- кина-2 человека.