Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент моноклональных антител к фактору некроза опухоли @ человека Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к штаммам гибридных клеток, секретирующих антитела определенной специфичности.

Цель изобретения - получение штамма, обеспечивающего высокий уровень синтезу МонАТ с высокой константой связьшания,

Штамм получают следующим образом.

Отмытые средой RPMI 1640 60 млн. клеток селезенки смешивают с клетками миеломы в соотношении 1:1 и центрифугируют 10 мин, 20048. Надосадоч- ную жидкость осторожно удаляют и к клеточному осадку по каплям добавляют в течение 1 мин 1 мл 50%-ного раствора полиэтиленгликоля 4000 с 10% по объему диметилсульфоксида в фосфатном буфере рН 7,2. Затем в течение 5 мин добавляют 10 мл среды RPMI 1640 ив - течение еще 10 мин доводят объем среды в пробирке до 50 мл. Клетки цен- трифугируют в течение 3 - 5 мин, осторожно удалают надосадочную жидкость, а к осадку добавляют 50 мл среды RPMI 1&40, содержащей 10% эмбриональной телячьей сьшорот- ки, IxlO M гипоксантина, аминоптерина, 1, тиквдина; 200 шМ L-глютамина, суспендируют

3

клетки пилетировaниek и распределя в 96-луночные плейты по 50x10 клеток в 100 мкл среды в лунки, в котрые за день до слияния высаживают мьппиные перитонеальные макрофаги ( клеток в лунку)

Клонь гидридных клеток становят заметными через 7-10 дней. Тестирование клонов проводят, когда клоны заполняют лунку на 20%. Положитель культуры клонируют методом предельго разведения в 96-луночных панеля на фидерном слое перитонеальных макрофагов, внося по 30, 300 и 30000 клеток на панель.

, Штамм депонирован под номером BCKK(II) № 229Д и характеризуется следующими признаками о

Культуральные свойства. При культивировании во флаконах клетки прикреплены к субстрату. При посеве 1Л10 кл./мл через А-5 дней плотность клеток составляе 2-5 ./мл,

Кратность рассева 5 раз. Стандартные условия выращивания,, Среда RPMJ-1640, .300 мг/мл 1-глюта- мина, 10 эмбрионал1 ной телячьей сыворотки, меркаптоэтанола, , 5% СО,.

Гибридные клетки перевивают и выращивают в виде асцитной опухоли в перитонеальной полости мьшей BaLB/c За 10 дней до введения клеток мышам предварительно вводят 0,5 мл приста на. При введении 2-5 млн. клеток через 14-20 дней образуется асцит. Характеристика МонАТ. Штамм продуцирует МонАТ класса IgGl. Вькод МонАТ в культуральной жидкости 80 мкг/мл при плотности клеток 1 млн/мл, в асцитной жидкост 9 мг/мл. Стабильность продуцировани МонАТ сохраняется на протяжении 50 пассажей в культуре. Криоконсервирование. Среда для замораживания 85% эмбрональной телячьей сьшоротки, 15% ди метилсульфоксида. Концентрация клет клеток/мл. Ампулы с клеткам выдерживают при в течение недели и переносят в дюары с жидким азотом. Режим размораживания водяна баня при 37°С. Жизнеспособность клеток (65%) после криоконсервирования определена по окрашиванию с трипано вым синим.

Контаминация.

10

J5

20

25

30

35

40

45

0

5

Бактерии, грибы, микоплазмы вирусы отсутствуют .

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Иммуноферментный анализ МонАТ.

Образцы, содержащие антитела (су- пернатанты клеточных культур, либо асцитная жидкость), тестируют методом твердофазного иммуноферментного анализа по связьшанию с препаратом рекомбинантного ФНОо. В лунки 96-лу- ночной плашки вносят по 200 нг белка в 50%-ном растворе концентрированной муравьиной кислоты в физиологическом растворе и оставляют на 18 ч при . Плашку отмьюают 0,1%-ным раствором твина 20 в 0,01 М натрий-фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCl (ФСБТ), рН 7,2, инкубируют с 200 мкл 1%-ного раствора бычьего сьшороточ- ного альбумина (БСА) в течение 1 ч при 37°С. Плашку отмьшают 3-4 раза ФСБТ и вносят в лунки по 50 мкл препарата, содержащего антитела. После инкубации в течение 1,5 ч. при плашку отмьшают ФСБТ и обрабатьтаюТ раствором антител к иммуноглобулинам мыши, конъюгированных с перокси- дазой хрена (50 мкл в лунку, разведение 1:1000, 1 ч при 37°С). Затем плашку отмьшают и вносят 50 мкл раствора ортофенилендиамина (1 мг/мл) в цитратном буфере (рН 4,5), содержащем 0,05% . Реакцию останавливают добавлением 50 мкл в лунку раствора 2 М серной кислоты. Взаимодействие моноклональных антител БМВ с ФИО о1, перенесенным на нитроцеллюлозу после диск-электрофореза в полиакриламидном геле, 13,5%.

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГЭ) проводят с использованием аппарата для вертикального электрофореза.

Лизат Escherichia coli и лизат продуцейта ФНО буфере для образца с меркаптозтанолом прогревают 5 мин при и наносят в ячейки геля. Электрофорез осуществляют при постоянной силе тока 35 нА.

Электроперенос разделенных компонентов из геля на нитроцеллюлозу (НЦ) с диаметром лор 0,45 мкм произ- водят в приборе для полусухого имму- ноблотинга в течение 1 ч. После пе 15853296

. реноса НЦ промьшшот дистиллированной внутрибрюшинно вводят 0,5 мл приставодой, затем помещают в 1%-ный раствор БСА на ФСБТ для блокировки неспеS noBoLrf 5 П° отделения клеток центрифуги- тГльнГГпГ п Рз е с горизон-рованием (AOO .g) асцитную жидкость

тальным перемешиванием.- «

После этого НЦ промьюают в растворе ФСБТ/Твин 3-4 раза, и помещают НЦ в культуральную жидкость, содержащую 10 антитела, на 4 ч при комнатной температуре. Затем НЦ 3-4 раза промьша- ют раствором ФСБТ/Твин и добавляют кроличьи антимьшиные антитела в ФСБТ с 1% БСА при разведении i:lUOO. Через 18 ч тщательно промьюают НЦ ТБР и проявляют реакцию в растворе субстрата, содержащем 4-хлор-1-нафтол и 0,005% H;jO. Для хранения и фотографирования НЦ промьтают в дистиллиро- 20 (1 ч, ). После отмьшки лунок ванной воде и высушивают на воздухе.

Пример 2. Получение и очистка моноклональкых антител.

Получение и очистка БМВ антитет

. ..ш и1ьис . ruii-ijrnui лииулины И ИН

из культуральнои и асцитной жидкости. 25 кубируют 1,5 ч при . Далее ИФА , Гибридные клетки наращивают в плас- проводят, как описано в примере 1 тиковых матрасах в среде RPMI 1640 f

содержащей 1 OVo ЭТС, 300 мг/л L-глу- тамина, меркаптоэтанола при посевной концентрации 3 1О млн. клеток/мл. Максимальная продукция иммуноглобулинов через 5-6 дней составляет 80 мкг/мл. Антитела, находя- щиеся в культуральнои жидкости, осаждают сульфатом аммония (27,7 г на 100 мл культуральнои жидкости), промьтают 0,2 М сульфатом аммония, дальнейшую очистку иммуноглобулинов осуществляют при помощи аффинной хроматографии с использованием ФИО о, им- .мобилизованного на бромцианактивиро- ванной сефарозе: осажденные сульфатом аммония образцы наносят на колонку объемом 5 мл, колонку промьшают фосфатно-буферным раствором, содерна . При введении 2-5tl О клеток через 14-20 дней образуется асцит. После отделения клеток цeнтp yl рованием (400 g) асцитную жидкое разбавляют до концентрации белка 10 мг/мл, высаливание и дальнейшую очистку иммуноглобулинов проводят, как описано выше.

Определение концентрации БМВ антител в культуральнои и асцитной жидкостях,

В лунки 96-луночной плашки вносят 15 по 250 кг кроличьих антител к IgG мыши в 0,05 М бикарбонатном буфере, рН 9,6, и инкубируют 18 ч при . Затем лунки плашки отмьшают ФСБТ и инкубируют с 200 мкл 1%-ного BSA (1 ч, ). После отмывки лунок ФСБТ по плашке раститровьюают образцы, содержащие МонАТ (50 мкл) ( в качестве стандарта используют нормальные мьш1иные 1 иммуноглобулины) и ин30

Концентрация моноклональных антител в культуральнои жидкости составляет 80 мкг/мл, в асцитной жидкости 9мг/мл

Определение константы связьшания МонАТ БМВ с ФНОоб

Константу связывания определяют при помощи ИФА по уравнению К

4МАВ - 2МАВ концентрация антител, соответствующая 50% связьтанию от максимального, МАВ - концентрация антител, соответств5то- щая 50% связьтанию от максимального в случае нанесения на плашку вдвое меньшего количества антигена. На лунку плашки наносят соответственно 1 и 2 мкг ФИО о( и ИФА проводят, как в примере 1. Константа связьшания анти- 45 тел с ФНО с составляет 3,4 О М .

Использование штамма позволяет получать антитела в количестве 80 мкг/мл культуральнои жидкости (в прототипе 14-20 мкг/мл), кон Н. (в про40

жащим 0,5М NaCl, рН 7,4. Специфические иммуноглобулины злюируют буфером ГЛИЩШ/НС1, рН 2,8. Элюат сразу же нейтрализуют М раствором трис, рН

11.:Раствор иммуноглобулинов диали- QQ станта аффинности. 3,4«I О зуют против забуферного физиологичес- тотипе - 2,). кого раствора, рН 7,2. Иммуноглобулин гомогенен по данным электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, gg При получении иммуноглобулинов из. асцитной жидкости гибридные клетки прививают мьш1ам линии BaLB/c. За 10- 14 дней до инъекции клеток мышам

Формулаиэобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животныхMus musculus BCKK(II) 229Д - продуцент моноклональных антител к фактору.некроза опухоли . о/ человека.

внутрибрюшинно вводят 0,5 мл приста5 П° отделения клеток центрифуги- рованием (AOO .g) асцитную жидкость

- «

0 (1 ч, ). После отмьшки лунок

. ..ш и1ьис . ruii-ijrnui лииулины И ИН

кубируют 1,5 ч при . Далее ИФА проводят, как описано в примере 1 f

на . При введении 2-5tl О клеток через 14-20 дней образуется асцит. После отделения клеток цeнтp yl рованием (400 g) асцитную жидкое разбавляют до концентрации белка 10 мг/мл, высаливание и дальнейшую очистку иммуноглобулинов проводят, как описано выше.

Определение концентрации БМВ антител в культуральнои и асцитной жидкостях,

В лунки 96-луночной плашки вносят 5 по 250 кг кроличьих антител к IgG мыши в 0,05 М бикарбонатном буфере, рН 9,6, и инкубируют 18 ч при . Затем лунки плашки отмьшают ФСБТ и инкубируют с 200 мкл 1%-ного BSA (1 ч, ). После отмывки лунок ФСБТ по плашке раститровьюают образцы, содержащие МонАТ (50 мкл) ( в качестве стандарта используют нормальные мьш1иные 1 иммуноглобулины) и ин25 кубируют 1,5 ч при . Далее ИФА проводят, как описано в примере 1 f

30

Концентрация моноклональных антител в культуральнои жидкости составляет 80 мкг/мл, в асцитной жидкости 9мг/мл.

Определение константы связьшания МонАТ БМВ с ФНОоб

Константу связывания определяют при помощи ИФА по уравнению К

4МАВ - 2МАВ концентрация антител, соответствующая 50% связьтанию от максимального, МАВ - концентрация антител, соответств5то- щая 50% связьтанию от максимального в случае нанесения на плашку вдвое меньшего количества антигена. На лунку плашки наносят соответственно 1 и 2 мкг ФИО о( и ИФА проводят, как в примере 1. Константа связьшания анти- 5 тел с ФНО с составляет 3,4 О М .

Использование штамма позволяет получать антитела в количестве 80 мкг/мл культуральнои жидкости (в прототипе 14-20 мкг/мл), кон Н. (в про0

Q станта аффинности. 3,4«I О тотипе - 2,). g

станта аффинности. 3,4«I О тотипе - 2,).

Формулаиэобретения

станта аффинности. 3,4«I О тотипе - 2,).

Штамм гибридных культивируемых клеток животныхMus musculus BCKK(II) 229Д - продуцент моноклональных антител к фактору.некроза опухоли . о/ человека.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к штаммам гибридных клеток, секретирующих антитела определенной специфичности. Цель изобретения - получение штамма, обеспечивающего высокий уровень биосинтеза МонАТ с высокой константой связывания. Штамм БМВ - продуцент МонАТ к рекомбинантному ФНО получен от слияния миеломных клеток X6XAG 653 со спленоцитами мыши, иммунизированной препаратом рекомбинатного ФНО. Слияние проводят при помощи полиэтиленгликоля с молекулярным весом 4000, содержащим 10% по объему диметилсульфоксида в фосфатно-буферном растворе. Штамм культивируется в стандартных условиях и может перевиваться в виде асцита. Штамм депонирован под номером ВСКК/П/ N 229Д. Продуцируемые МонАТ относятся к подклассу IGG1. Продуктивность в культуральной жидкости 80 мкг/мл, в асцитной жидкости 9 мг/мл. Константа аффинности 3,4 .10 9М -1.