(О
С
Изобре;тение относится к биотехнологии и представляет собой новый Alcaligenes paradoxus В-3978, яв 1яющийся продуцентом активной ка- те:(сол-1,2-оксигеназы (К.Ф.1.12.11.1), ко -орая может быть использована для би|экаталитического получения цис, ци -муконовой кислоты.
: Цель изобретения - выявление штамма, обладающего более высокой удель- но активностью катехол-1,2-оксиге- назы и уменьшение времени культивирования.
Штамм Alcaligenes paradoxus В-3978 выцелягот методом накопительной культуры из почвенных образцов, получен методом длительной адаптации к росту нагароматических углеводородах (бен- эо1йная кислота, пирокатехин) в качестве единственных источников углерода
и энергии.
Штамм Alcaligenes paradoxus В-3978 следующие характеристики.
Культурально-морфологические приз- иг ки. Клетки - одиночные или соединенные по две кокковидные палочки. Псдвижные. Движутся при помощи пе- рйтрихальных жгутиков. Грамотрица- т4льные. Эндоспор не образуют. При ревете на МПА образует отдельной, с к- формы колонии5 к центру чуть П1|иподня:тые со срезанной верхушкой „ На третьи сутки роста в диаметре ксшонии достигают 5-6 мм. С возраст- тем колония растекается по агару. IIciBepxHocTb матовая, консистенция мг1жущаяся пастообразная. Непрозрач™ HjjiH, окрашена в кремовый цвет. Край кфлоний слабо волнистьш, внутренняя структура гомогенная. В агар при р( не врастают. На синтетической агаризованной среде с бензоатом рост и форма колоний.аналогичны росту на . На МПБ образует тонкую пленку cig слабой мутью и хлопьевидным белым осадком.,
Физиолого-биохимические свойства, )об. Оптимальная температура роста 25-30 С, максимальная 37°С, оптимальная рН 6,0-7,5.
Оксидазбположителек. Каталазопо- лржителен. Целлюлозу не расщепляет. У|реазная активность отсутствует. Крахмал гидролизует. Желатину не раз жйжает, молоко не пептонизирует. Неорганический азот усваивает в аммонийной форме. В аэробных и анаэробных условиях нитраты и нитриты не ре
дуцирует. Сероводород, меркаптаны и индол не образует. Слабо аммонифицирует пептон. Res кислотообразования г усваивает сахарозу, рамнозу, лактозу, ксилозу, галактозу, арабинозу. Подкисляет среду при росте на среде Хью и Лейфсона с глюкозой. Усваивает маннит, инозит, дульцит, сорбит. В 10 качестве единственного источника углерода использует цитрат (без ростового фактора).
Штамм чувствителен к стрептомицину и тетрациклину и высокочувствите- 15 лен к мономицину. Непатогенен.
Пример 1. Штамм А1.paradoxus В-3978 культивируют в сраде, содержащей, г/л: KRjPO 3,4, 4,3, (NH4). 2, MgCli 0,343, CaClj 0,026, 20 MnCli 0,0015, FeSO 0,008, 0,002, бензойная кислота 1,2, рН среды 6,5с Стерилизация - 0,05 атм 40 мин.
Посевной материал вносят в объе- 25 ме 10 мл с содержанием 0,6 мг/мл сухой биомассы в колбЪ объемом 750 мл со 150 мл ростовой среды. Ферментацию проводят при 29 С на круговой качалке с 220 об/мин.
30 На фиг.1 и 2 представлены динамика накопления биомассы, скорость потребления субстрата, а также изменение активности катехол.-1,2-оксигеча- зы в процессе роста культуры Alcali- ,с genes paradoxus В-3978.
Установлено, что HaH6oJ3bmaH активность катехол-1,2-оксигеназы в расчете на мг сухой биомассы культуры наблюдается в конце логарифмичес- 40 кой фазы роста популяции, т.е. на 6-й час культивирования.
Клетки отделяют от среды на 6-й час ферментации центрифугированием при 4500 g в течение 40 мин. Выход д5 биомассы 3 г влажных клеток на 1 л ростовой среды. Дважды промьгоают 0,05 М калийфосфатным буфером рН 7,5 н разрушают механическим способом на прессе Хьюза при давлении jQ 100 кр/см с предварительным замораживанием. Полученную биомассу г.ентри- фугируют при 20000 g 30 мин и в су- пернатанте определяют активность катехол-1 ,2-оксигеназы.
гг Метод определения спектрофотомет- рический, по увеличению поглощения при 260 нм. Реакционная смесь в общем объеме 3,0 мл содержит 2,89 мл 0,1 М калийфосфатного буфера рН 7,5,
0,06 мл 0,01 М катехола и 0,05 мл бесклеточного экстракта, содержащего 0,1-1 ед. активности/мл пирокатеха- зы. Показания прибора (СФ-46) запи- сьшаются в интервалах 30 с в течение 3 мин. Единица активности пирокате- хазы определяется как количество фермента, катализирующее образование 1 мкМ цис, цис-муконовой кислоты в 1 мин. Молярный коэффициент экстин- ции цис, цис-муконата. принимают равным 16,800 при 260 нм. Удельную активность определяют как количество единиц активности, содержащихся в 1 мг белка. Содержание блока определяют по величине поглощения при 280 и 260 нм. В этих условиях удельная активность фермента 2,7 ед/мг белка.
П р и м е р 2. Бактерии Alcali- genes paradoxus культивируют аналогично примеру 1, но питательная сре49581-1
да имеет следующий состав, г/л: бен- зоат натрия 3, дрожжевой экстракт 1),5, K,iHP04 1,2, NaCl 1,6, FeSO. 0,1, 5 MgSO. 0,2. Посевной материал вносят в количестве 20 мл. На 6-й час культивирования выход биомассы 3,5 г сьфых клеток на 1 л ростовой среды. Удельная активность катехол-1,2-ок10 сигеназы в бесклеточном экстракте 2,7 ед/мг белка.
Таким образом, новьй штамм позволяет более чем в три раза увеличить удельную активность катехол-1,2-окси15 геназы и сократить время культивирования.
Формула изобретение
20 Штам бактерий Alcaligenes paradoxus ВКПМ,В-3978 - продуцент катехол-1 ,2-оксигеназы.
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой Новый штамм бактерий Alcaligenes paradoxus ВКПМ В-3978 - продуцент катехол-1,2- оксигеназы, фермента, используемого для биокаталитического получения цис, цис-муконовой кислоты. Цель изобретения - повышение удельной активности катехол-1,2Чэксигеназы и уменьшение времени культивирования. Штамм культивируют на минеральной питательной среде, содержащей бензойную кислоту в качестве источника углерода. Время культивирования 6 ч-.- Удельная активность катехол-1,2-окси- геназы 2,7 ед/мг белка. 2 ил.
6
Фиг,1
8
ю.м;
аб:
й«
02
г ч S
Фиг,2
W М
