Штамм бактерий ALcaLIGeNeS FaecaLIS, используемый для очистки сточных вод от 2-хлор-цис,цис-муконовой кислоты Советский патент 1988 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C12N1/20 C12R1/05 C02F3/34 C02F101/30 

О5

го

со

Изобретение относится к микробио- логической промышленности и касается нового штамма бактерий, используемого для очистки сточных вод от стойких и токсических соединений.

Цель изобретения - получение штамма бактерий, способного утилизировать 2-хлормуконовую кислоту, в результате чего происходит полное разложение этого соединения с 100%-ным дехлорированием органической молекулы.

Штамм бактерий Alcaligenes faeca- lis ВКПМ В-3636 (ИНМИ-КЗ-5) выделен из огородной почвы методом накопи- тельной культуры на минеральной среде, полученной следуюшрм образом.

Колбы, объемом 0,5 л, содержащие 100 мл cpe;joi следующего состава,г/л: KjHPO ЗП-гО 4,0 NaH5.P04 2Н20 0,4$ (NH 4)50, 0,5; MgS04-7H20 0,15-, Ca(NOj)5-4H20 -0,005; Na MoO 2H-iO 0,004; 3- хлорбензойная кислота 0,5, засевали культурой бактерий Acineto- bacter calcoaceticus ИНМИ-КЗ-3и культивировали до полного исчезновения субстрата. Одновременно с исчезновением 3-хл6рбензойной кислоты в среде накапливается 2-хлор-дис, дис-муко- новая кислота. После окончания роста культуральную жидкость отделяли от клеток центрифугированием (20 мин при 10 тыс.об/мин) и затем стерилизовали фильтрованием (фильтр Зейтда). К полученной таким образом среде до- бавляли стерильный раствор дрожжевого экстракта (конечная концентрация 10 мг/л) и разливали по 2 мл в пробирки,

Дпя приготовления агаризованной cpe ды культуралъную жидкость, полученную как описа но выше, концентрировали под вакуумом в 2 раза, стерилизовали фильтрованием и добавляли стерильный раствор дрожжевого экстракта. Сконцент- рированную культуральную жидкость вносили в 3%-ный расплавленный водный агар в отношении 1:1 и среду разливали по чашкам. Полученная этим способом жидкая и плотная среды содержали 0,25 г/л 2-хлор-цис, цис-муконовой кислоты.

При выделении штамма 2 г садовой почвы вносили в колбу объемом 250 мл.

содержащую 50 мл среды следующего состава, г/л: KiHP04-3HiG 4,0; 0,4i (NH),S04 0,5j MgS04.-7HjO 0,15; Ca(NOi),-4HaO 0,005; 2H jO 0,004; 3-хлорбензойная кислота

5

0 5 0 s

jg .j

0

5

0,25, и выдерживали при 28°С. После 20 сут инкубации 5 мл накопительной культуры вносили в колбу со свежей средой и культивировали в тех же условиях. Через 10 сут колбе наблюдали полное исчезновение 3-хлорбензой- ной кислоты. Из этой колбы сделали высев в 20 пробирок, содержащих по

2мл минеральной среды с 2-хлор-цис, цис-муконовой кислотой. Через 10 сут в пробирках наблюдали полное исчезновение 2-хлор-цис, цис-муковновой, кислоты. С целью получения наиболее активного штамма, утилизирующего 2-хлор-цис, цис-муконовуга кислоту, было проведено обогащение накопительной культуры бактериями, утилизирующими это соединение. Для этого из пробирки, в которой процесс утилизации 2-хлор-цйс, цис-муконовой кислоты шел наиболее быстро, делали высев в 10 пробирок, содержащих минеральную среду с 2-хлор-цис, цис-муконовой кислотой. Из этих пробирок была опять отобрана одна, в которой процесс утилизации ксенобиотика шел быстрее.Эту операцию повторяли 2 раза. Чистую культуру бактерий выделили из отдельной колонии, полученной путем рассева обогащенной накопительной культуры на чашки с агаризованной минеральной средой с 2-хлор-цис, цис-муконовой кислотой. Чистую культуру бактерий еженедельно пересевали в течение

3мес на жидкой минеральной среде, содержащей 0,25 г/л 2-хлор-цис, цис- муконовой кислоты. Окончательно штамм Alcaligenes faecalis ИНМИ-КЗ-5 получен путем выделения наиболее быстро растущей колонии на минеральной агаризованной среде с 0,5 г/л 2-хлор- цис, цис-муконовой кислотой.

1,.

Штамм сохраняет жизнеспособность

в течение 6 мес при хранении на скошенном мясо-пептонном агаре и в течение 2 лет в лиофильно высушенном состоянии.

Штамм Alcaligenes faecalis ИНМИ-КЗ-5 имеет следующие культураль- но-морфологические и физико-биохимические характеристики.

Морфолого-культуральные свойства.

Клетки кокковидные палочки, размеры О,5x0,5-1,3 мкм, подвижные, имеют перитрихально расположенные жгутики, грамотрицательные, неспороносные.

Рост на плотных средах. Мясо-пептонный агар, 28°С, 7 сут (табл. 1).

Таблица 1 5

Штрих

I

Колонии

й, тестос ровным

Бесцветные,плоские, гладкие, блестящие с ровными краями, тестообразные, пигмент в среду не вьщеляют

Картофельный агар, 28°С, 7 сут (табл. 2).

Таблица2

Штрих

I

Колонии

й, тестос ровным

Бесцветные,плоские, гладкие, блестящие с ровными краями, тестообразные, пигмент в среду не вьщеляют

Минеральная агаризованная среда с 2-хлор-цис, цис-муконовой кислотой (0,7 г/л), 28°С, 7 сут (табл. 3). 35

Таблица 3

Штрих

Колонии

Бесцветные,плос- кие, гладкие, блестящие с ровными краями,тестообразные, пиг- 45 мент в среду не выделяют

Рост на жидких средах.

Мясо-пептонный бульон, 28 С, 5сут.

Характер роста - образуется муть, плотный осадок, который при взбалтывании легко взмучивается. Пигмент в среду не выделяется.

Жидкая минеральная среда с 2-хлор- -цис, цис-муконовой кислотой (0,7 г/л) 28°С, 7 сут.

5

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

Характер роста - образуется муть, плотный осадок, который при взбалтывании легко взмучивается.

Физико-биохимические свойства.

Аэроб, способен к анаэробному дыханию в присутствии нитрата. Дает положительную каталазную и оксидазную реакции. Желатин не разжижает, крахмал не гидролизует. Не фиксирует га- зообразный азот. Растет при 37 С, не растет при 38°С. Оптимальная температура для роста 28-30°С. Чувствителен к 50 ед. пенициллина.

Источники углерода.

Штамм хорошо растет на мясо-пеп- тонном бульоне, мясо-пептонном агаре, картофельном агаре и минеральной ага- ризованной среде следующего состава, г/л: К,НР04-ЗН,0 4,OiNaH, 2H.,0 0,4j (NH ц), S0/-0,5; MgS04-7HjO 0,15, Ca(NO-i) 0,005, никотиновая кислота 0,005, источник углерода 0,5, рН 7,0-7,3. В качестве источника углерода используют: органические кислоты - ацетат, цитрат, сукцинат, ма- лонат, левулинат, 2-хлор-цис, цис- муконовую кислоту, аминокислоты - пролин, серин, норлейцин.

Не усваивает углеводы: D-глюкозу, D-галактозу, D-фруктозу, D-рамнозу, D-ксилозу, целлобиозу, сахарозу, лактозу, сахароспирты: инозит, маннит, сорбит, адонит, органические кислоты: 3-оксибензоат, 4-оксибензоат, 3,4- -диоксибензоат, малеат, адипат, аминокислоты: валин, орнитин, глицин, аргинин, лизин, лейцин, триптофан.

Факторы роста - никотиновая кислота (0,0005 г/л).

Источники азота - усваивает аммонийный и нитратный азот.

Пример 1. Разложение 2-хлор- цис, цис-муконовой кислоты в минеральной среде. Культуру A.faecalis ИНМИ-КЗ-5 выращивают на картофельном или мясо-пептонном агаре в течение 5 дней. Выросшей культурой засевают колбы емкостью 250 мл, содержащие 50 мл среды. Состав среды, г/л: К2НР04 ЗН О 4,0i NaH,jP04-2H,;0 0,4 (№14)7304 0,5; MgSO 4 7Н20 0,15;, никотиновая кислота 0,0005-, 2-хлор- цис, цис-муконовая кислота 0,7, водопроводная вода. Культивирование проводят на качалке при в течение 7 сут. Приготовленный посевной материал в количестве 10 мл вносят в

5137

. .

750 мл колбы, содержащие 100 мл среды того же состава. В этих условиях 2-хлормуконовая кислота исчезает за 120 ч, высвобождение атомов хлора составляет 100%,

Пример 2. Разложение 2-хлор- цис, цис-муконовой кислоты в сточной воде. . .

Штамм выращивали на сточных водах содержащих следующие компоненты, г/л

Редуцирующие вещества 1,2

Монокарбоновые кислоты

(в пересчете на уксусную кислоту) Летучие кислоты 2-хлор-цис, цис-муко- новая кислота

2,0

0,3 0.4

г

Q

5

Азот0,12

Фосфор0,07

Сточную воду засевали посевным материалом в количестве 10%.

Культивирование осуществляли в колбах объемом 500 мл, содержащих 100 мл сточной воды на качалке 180 об/мин при 28°С. В этих условиях штамм АО faecal is ИНМИ-КЗ-5 полностью разлагает 0,4 г/л 2-хлор-цис, цис-му- коновой кислоты за 160 ч,

Формулаизобретения

Штамм бактерий Alcaligenes faeca- lis ВКГМ В-3636, используемый для очистки сточных вод от 2-хлор-цис, цис-муконовой кислоты.

Изобретение относится к микробиологической промьшленности и касается нового штамма бактерий, используемого для очистки сточных вод от стойких и токсических соединений. Целью изобретени Я является получение нового штамма бактерий, способного утилизировать 2-хлормуконовую кислоту, в результате чего происходит полное разложение этого соединения с 100%-ным- дехлорированием органической молекулы. Штамм бактерий Alcali- genes faecalis ВКПМ В-3636 (НИМИ- . -КЗ-5) выделен из огородной почвы методом накопительной культуры и способен за 120-160 ч разрушать полностью 0,4-0,7 г/л 2-хлор-цис, цис- муконовой кислоты. 3 табл. (Л