Штамм дрожжей CaNDIDa ReQUINII - продуцент алкогольдегидрогеназы Советский патент 1992 года по МПК C12N1/16 C12N9/04 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения штаммов - продуцентов алкогольдегидрогеназы, применяемой в молекулярной биологии, фармацевтической и медицинской промышленности.

Известны различные микроорганизмы, способные синтезировать алкогольдегидро- геназу. Широко применяются для получения препаратов алкогольдегидрогеназы штаммы хлебопекарных дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Исходная удельная активность алкогольдегидрогеназы (АДГ) клеток этих штаммов составляет 0.11- 0.76 ед/мг.

Наиболее близкими по достигаемому

Ъоложительному эффекту являются штаммы

Candida regulnll 316 и Candida regulnl-232,

находящиеся в музее культур Института

микробиологии АН БССР, образующие алкогольдегидрогеназу с удельной активностью 1.38 и 2,27 ед/мг соответственно.

Однако известные штаммы обладают сравнительно низким уровнем активности АДГ

Целью изобретения является получение штамма - продуцента АДГ с более высокой и стабильной активностью фермента при росте на среде с этиловым спиртом.

Штамм Candida regulnll ЛС-15 прлучен с использованием традиционных генетико- селекционных приемов из штамма Candida regulnll 316. Процесс получения штамма включает обработку сгущенной суточной суспензии клеток штамма C.regulnll мутаге- ном (0.0075М фенетил-ди-2-хлорэтиламин) и отбором мутантных клонов с использованием селектирующего агента - монофторук- сусная кислота (7.8 г/л). Из выросших на среде с антиметаболитом (МФУ) 10-15 клонов целенаправленно отбирают штамм C.regulnll ЛС-15, обладающий наивысшей активностью алкогольдегидрогеназы.

Полученный штамм дрожжей Candida regulnll ЛС-15 депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ АН СССР под номером ВКМ CR-321 Д.

Штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими и физио- лого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки удлиненные, единичные, веретенообразные, длина 4.5-9,0 мкм, ширина 1,5-3,0 мкм.

Рост на жидких средах.

Солодовое сусло 7° по Баллингу, 26°С, двое суток

(без встряхивания)серая пленка, сползающая на стенки, небольшой осадок белого цвета,

среда без изменений

Через месяц (17°С) при стоянии пленка на стенке сосуда, опускающаяся на дно (на качалке)

осветление среды

сильное помутнение среды, кольцо отсутствует выпадает обильный осадок белого цвета

осветление среды

Жидкая минеральная среда с этанолом (2,0 об%), 3-е сут, качалка, 30°С

Сильное помутнение белого цвета, выпадает обильный осадок белого цвета, Через месяц (17°С) при стоянии пленка не образуется.

Подкисление среды с рН от 4,5 до 3,2.

Рост на плотных средах.

Сусло-агар, 30°С, трое суток, (посев штрихом) рост обильный, непрозрачный, край зубчатый, серо-белого цвета, колонии круглые, до 10 мм, матовые, край зубчатый, консистенция пастообразная, профиль слабо выпуклый, серо-белого цвета.

Через месяц (17°С) колонии кремового цвета, слегка гранулированы, опушенные псевдомицелием.

Минеральная агаризованная среда с этанолом (2,0 об.%), трое суток, 30°С, (посев штрихом): рост обильный, сплошной, переходящий в цепочку отдельных колоний, край ровный, серо-белого цвета, колонии круглые, 3,5 мм, матовые, край ровный, профиль слабо выпуклый, пастообразной консистенции, серо-белого цвета.

Через месяц (17°С) колонии серого цвета, не гранулированы, край не опушен псевдомицелием.

Рост на глюкозо-картофельном агаре: на стекле отдельные клетки и псевдомицелий.

Кукурузный агар: на стекле (анаэробные

условия) псевдомицелий и почкующиеся клетки.

Истинный мицелий и артоспоры отсутствуют, Растет без витаминов на среде Ри- дер+глюкоза.

0 Физиолого-биологические признаки

Температурный диапазон роста 8-43°С. Оптимальная температура роста 28-38°С. Максимальная скорость роста 37-40°С. Оптимум рН 3,8-4,5.

5 Растет на среде с 50% глюкозы, не растет на среде с 10% NaCI,

Сбраживает только глюкозу на среде: дрожжевая вода +2,0% углевода. Ассимилирует глюкозу, этанол, глицерин, молочную

0 кислоту, янтарную кислоту, лимонную кислоту. Не ассимилирует галактозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, лактозу рафинозу, крахмал, ксилозу, L-арабинозу, D-арабино- зу, рибозу, рамнозу, маннит, инозит.

5Нитраты и нитриты не ассимилирует. Усваивает мочевину, аммонийные соли, пептон, аспарагин. не усваивает желатину, Обладает уреазной активностью (на среде Христенсена).

0 Хорошо хранится в лиофильно высушенном состоянии. Штамм не токсичен и не патогенен.

Штамм ВКМ ИБФМ АН СССР CR-321 Д идентифицирован как штамм вида Candida

5 regulnll,

Посевной материал получают выращиванием штаммов C.regulnil ЛС-15, C.regulnli 316-232, C.regulnll 316 в колбах в жидкой питательной среде следующего состава,

0 г/л: мочевина 2.0; NaH2POo 2H20 3,5; К2НР04 -ЗНаО 3,8; MgSOi 7Н20 1,4: концентрат микроэлементов 2 мл: этиловый спирт 2,0 об.%, вода дистиллированная до 1 л. Величину рН доводят фосфорной кислотой

5 до 4,5. Этанол и соль Мд вносят в колбы после автоклавирования.

Полученный посевной материал в количестве 8-10% от объема питательной среды (50 мл) вносят в колбы со свежей средой

0 (состав приведен выше). Культивирование осуществляют при 30°С на качалке (200 об/мин). По мере роста штаммов через определенные промежутки времени (1.5-2,0 ч) урожай биомассы (каждый раз берут отдель5 ные колбы) клеток отделяют от культуральной жидкости с помощью центрифугирования (3000 об/мин) и отмывают от компонентов питательной среды 0,1 М фосфатным буфером (рН 7,0). Затем клетки подвергают деструкции с помощью экструзии из

замороженного состояния. Полученный дезинтеграт центрифугируют (12000 об/мин) в течение 20 мин для отделения целых клеток, клеточных осколкоб и супер- натант анализируют на наличие алкогольде- гидрогеназой активности с использованием спектрофотометрического метода. Удельную активность фермента выражают в ед/мг - количество мкМ НАД, восстановленного ферментом за 1 мин. разделенное на количество белка (мг) внесенного в реакционную смесь.

В таблице приводятся данные сопоставительного анализа по уровню активности АДГ и времени достижения максимальной активности, полученные при экспериментальной (лабораторной) проверке всех трех штаммов.

Преимущества штамма C.regulnll ЛС- 15ВКМ CR-321 Д по сравнению со штаммом C.regulnll 316-232 и C.reguinll 316:

- более высокий уровень удельной активности алкогольдегидрогеназы (на 50% в среднем для штамма 316-323 и на 146% в среднем для штамма 316).

- менее короткий срок ферментации для достижения максимальной активности, что позволяет в условиях производства экономить электроэнергию, а также получать более высокий выход целевого продукта с единицы объема ферментационного оборудования.

Таким образом, штамм Candida regulnll ЛС-15 CR-321 Д не только превосходит по уровню активности алкогольдегидрогеназы известные штаммы, но и является более технологичным по своим свойствам.

Формула изобретения Штамм дрожжей Candida regulnll BKM CR-321 Д - продуцент алкогольдегидрогеназы.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается штам- мамикроорганизма-продуцента алкогольдегидрогеназы (АДГ). Цель изобретения - получение штамма дрожжей-проду- цента АД Г с более высокой и стабильной активностью фермента при росте на среде с этиловым спиртом. Штамм Candida regulnll ЛС-15 получен с использованием традиционных генетико-селекционных приемов и зарегистрирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ АН СССР под номером ВКИ СРх-321Д. Штамм культивируют на синтетической среде с 2.0 об.% этанола при рН 4.5 и температуре 30°С в течение 14 ч. Активность алкогольдегидрогеназы составляет 3,4 ед/мг - что превышает активность тЬго же фермента у известных штаммов Candida regulnll на 50-146%. 1 табл. г Ic