Штамм бактерий RноDососсUS еRYтнRороLIS - продуцент эпоксидирующей монооксигеназы Советский патент 1992 года по МПК C12N9/04 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий, растущего в аэробных условиях на питательной среде, содержащей пропан в качестве единственного источника углерода и энергии и синтезирующего эпоксидирующую мо- нооксигеназу.

Известны пропанутилизирующие микроорганизмы, относящиеся к различным родам, растущие в атмосфере пропана как единственного источника углерода и синтезирующие эпоксидирующую монооксигена- зу, активность которой составляет 0,4-2,8 мкмоль окиси пропилена в 1 ч на 1 мг клеточного белка.

Известен также пропанутилизирующий штамм Rhodococcus rhodochrous PNKb I, обладающий активной пропаноксигеназной ферментной системой и катализирующий образование эпоксида (1,2-эпоксипропана) из пропилена. Активность экпосидирующей моноокаигеназы составляет 0,63 мкмоль окиси пропилена в 1 ч на 1 мг белка.

Цель изобретения - получение нового штамма бактерий, обладающего более высокой активностью эпоксидирующей моно- оксигеназы.

Штамм бактерий Rhodococcus erythropolls ВКПМ S-925 выделен методом накопительной культуры из почвенных образцов и получен путем длительной индуциVI

ел го VJ

Os

VJ

рованмой селекции к пропану как единстве- ному источнику углерода и энергии при росте на минеральной среде.

Штамм Rhodococcus erythropolis ВКПМ S-925 имеет следующую характеристику.

Культура л ьно-морфологические признаки. Среды для хранения - МПА и минеральные среды с пропаном в качестве источника углерода. Характерной особенностью отобранного штамма является рост на всех твердых питательных средах (сусло- агар, глицериновый агар, мясопептонный агар (МПА). среда Чапека) с образованием колоний кремового цвета с розовым оттенком, который при многократных пересевах на среду Foster, Davis (1966) и выращивании в атмосфере пропан-воздух приобретает оранжевый оттенок. При росте на сусло-агаре и МПА через 12-16 ч клетки культуры прямые, слегка искривленные, иногда ела- боветвящиеся, часто расположены V-образ- но, реже одиночно, размер клеток (0,6-1)- (6-8) мкм, через 16-24 ч клетка укорачивается до кокковидных, что является характерным признаком рода Rhodococcus, грамположительны, неспороносны, некислотоустойчивы.

Физиолого-биохимические признаки. Аэроб, оптимальная температура роста 28- 30°С, рН среды 6,8-7,2, при 45°С не растет. Хорошо растет на минеральных средах в атмосфере пропана; метан не утилизируется микроорганизмом; хорошо растет в присутствии пропилового, бутилового спиртов, пропилен не является ростовым субстра- том; усваивает моносахара, содержащие 6 атомов углерода, дисэхариды (сахароза, мальтоза, лактоза). Углеводороды с длиной цепи Cs-Cie не ассимилируются, не усваиваются арабиноза, ксилоза, не гидролизует- ся крахмал. Субстратами также могут служить ацетат, пируват, цитрат. Штамм при росте на пропане образует такое же количество биомассы, как и на легкоутилизируемых сахарах. При глубинном культиви- ровании предпочтительным источником азота являются соли аммония.

Штамм непатогенен При росте на пропане культура обладает активной моноокси- геназной ферментной системой, катализирующей превращение газообразных алкенов (этилена, пропилена) в окиси алкенов (1,2-эпоксиды). ,

Культуру штамма хранят в эксикаторе в атмосфере пропан-воздух в объемном соот- ношении 1:1, в качестве источника пропана используют бытовой пропан, температура хранения 4°С, на среде Foster, Davis (1966), следующего состава, г/л: NaNCb 2,0; Na2HP04 0,21; №Н2Р04 0,09; MgS04-7H20

0,2; KCI 0,04; CaCl2 0,05; FeSO« 1 мг; CuS04 0,01 мг; НзВОз0,02 мг;Мп504 0,02 Mr;ZnS04 14 мг; МоОз 0,02 мг; агар 2%, рН 7,0, в течение 3 мес, однако желательно более часто пересевать на свежую среду (через 2 нед).

Для размножения культуры используют среду, приведенную выше. Косяки, засеянные культурой и закрытые ватной пробкой, помещают в эксикатор, из которого удален воздух и замещен на газовую смесь пропан- воздух. Эксикатор помещают в термостат при 28-30°С. Рост культуры продолжается в течение 10-14 дней, после этого культуру используют в работе. Оставшиеся косяки с выросшей культурой хранят в эксикаторе в атмосфере пропана при 4°С. При глубинном культивировани на минеральной среде с пропаном в качестве источника углерода и энергии через 72-96 ч штамм Rhodococcus erythropolis ВКПМ S-925 образует биомассу в количестве 0,7-1,0 г на 1 л культуральной жидкость (по сухому весу). Клеточная суспензия бактерий способна катализировать реакцию эпоксидирования пропилена в окись пропилена с выходом 0,12-0,2 мг окиси пропилена на 1 мл реакционной смеси в течение 30 мин.

Пример. Выращивание культуры Rhodococcus erythropolis ВКПМ S-925 проводят глубинным Способом на среде следующего состава, г/л: 1,5; MgSO/j 1,0; CaCl2 0,2; FeS(V7H20 0,004; 2 мл Na-фос- фатного буфера рН 6,8 (№2НРСм 107 г/л, КН2Р04 39 г/л), 2 мл микроэлементов по Пфеннингу (Трилон Б 500 мг: FeS04 200 мг; ZnS04 7H20 10 мг; MnCl2 4Н20 3,0 мг; НзВОз 30 мг; CuS04-5H20 1,0 мг; NiCb- 6Н20 2,0 мг; СоС12 2Н20 20 мг; Н20 500 мл), рН среды 7,0, Стерилизация среды 0,5 атм, 40 мин. Культивирование проводят в колбах емкостью 750 мл на качалке, делающей 200- 220 об/мин, при температуре 28-30°С в течение Зсут. В колбы вносят по 100мл среды, инокулируют суспензией культуры, выросшей на косяках в атмосфере пропана в течение 10-14 сут. Из колб откачивают воздух и заполняют газовой смесью пропан-воздух. Рост культуры при глубинном культивировании определяют по образованию мутности, оптическую плотность (ОП) которой определяют при 600 нм. Через 3 сут роста ОП культуры составляет 1,2-1,4. Выросшие клетки отделяют центрифугированием при 4°С при 10000 об/мин в течение 20 мин. Полученную клеточную биомассу дважды промывают охлажденным 0,05 М Na-фос- фатным буфером рН 7,0, затем суспендируют в этом же буфере в таком количестве, jn-обы 1 мл буфера содержал 10-15 мг сухих

клеток (концентрацию клеток определяют по ОП при 600 нм), Выход сухих клеток 0,7 г/л культуральной жидкости.

Монооксигенэзную активность клеточной суспензии определяют следующим образом. Во флаконы емкостью 10 мл, закрытые резиновыми пробками, вносят 1 мл клеточной суспензии, содержащей 10 мг сухих клеток, приготовленной как описано выше, воздух из флаконов удаляют шприцем и замещают на газовую смесь пропилен (субстрат) + кислород в объемном соотношении 1:1. Флаконы помещают в термостатированную качалку при температуре 35°С при перемешивании. Через 30, 60, 120 мин флаконы охлаждают, центрифугируют при 5000 об/мин и супернатант наносят на хро- матографическую колонку, заполненную порапаком Q. Активность клеточной суспензии выражают в микромолях образовавшейся окиси пропилена в 1 ч на 1 мг сухих клеток или 1 мг клеточного белка. При содержании в 1 мл клеточной суспензии 10 мг сухих клеток в течение 30 мин в 1 мл реакционной

смеси обнаружено 0,18мг окиси пропилена, что соответствует активности 0,62 мкмоль/ч- мг сухих клеток или 2,5 мкмоль/ч-мг клеточного белка.

Таким образом, новый штамм

Rhodococcus erythropolls ВКПМ-5-925 при культивировании на питательной среде с пропаном в качестве единственного источника углерода и энергии синтезирует активную эпоксидирующую монооксигеназу и

может быть использован для получения окиси пропилена из пропилена.

Формула изобретения Штамм бактерий Rhodococcus

erythropolls ВКПМ S-925 - продуцент эпок- сидирующей монооксигеназы.

Использование: может быть использовано для получения 1,2-эпоксидов из газообразных алкенов. Сущность изобретения: штамм выращивают глубинным способом на питательной среде следующего состава, г/л: NH4CI 1,5; MgSO 1,0; СаСДО; FeS04 «7Н20 0,004; 2 мл Na-фосфатного буфера, рН 6,8; 2 мл микроэлементов по Пфеннингу, рН среды 7,0. Культивирование проводят в колбах, из которых предварительно откачивают воздух и замещают на смесь пропан-воздух