Способ культивирования нервной ткани Советский патент 1989 года по МПК C12M1/00 

1

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной и клинической медицине.

Цель изобретения - получение высокодифференцированной нервной ткани из эмбриональных зачатков.

Пример. Диффузионную камеру готовят следующим образом.

На торцовые стенки наружного и внутреннего колец из оргстекла приклеивают нуклеопоровые фильтры. Изготовленные таким образом половинки диффузионных камер стерилизуют,проверяют на герметичность, обрабатьтают уль-f 5 трафиолетом. , На внутреннюю поверхность фильтра наружного кольца в капле культуральной среды или Хенкса)

10

f 5

10

помещают эмбриональные ганглии, взятые от зародышей крыс 18 и 20 дня развития. Это кольцо закрывают внутренним кольцом при помощи клея в стерильных условиях.

Каждой из 30 наркотизированных при помощи эфира крыс, самцов линии Вистар, имплантируют свободно по 2 камеры в ,илеоцекальнук область брюшной полости. Из извлеченных из брюшной полос- ти камер приготавливают тотальные препараты, которые исследуют с помо щью известных нейрогистологических методик,

В исходном материале, используемом для культивирования, нейтральные элег менты представлены незрелыми нейро10

31454838

,бластами и молодыми нейронами. Клет- и эти имеют крупное ядро с двумя ядрышками, небольшой объем цитоплазмы, а у некоторых выявляется и один тонкий безмякотныйотросток. Между нейробластами находятся немногочислен-- ные сателлиты, некоторые из которых осуществляют митотическое деление.

Через 7 сут после трансплантации на нукЛеопоровых фильтрах, также как и в культурах in vitro, отчетливо видны две зоны: 1 - центральная, представленная нейронами чувствительных ганглиев, которые, ло, не мигрируют, и 2 - зона роста, состоящая из леммоцитов и сателлитов.

Нейтроны в центральной зоне распо- лага(отся разрежено и количество их по сравнению с исходным материалом уменьшается. Нервные клетки имеют разнообразную форму тела: округлую, многоугольную, веретенообразную, неправильную. Часть нейронов , прилегающих к зоне роста, приобретает вытянутый вид, причем продольная ось их тела совпадает с направлением миграции тяжей леммоцитов из центра ганглия. В процессе дифференцировки нейронов увеличиваются размеры их тела: если исходный эмбриональньй материал содержит только нейробласты диаметром мкм, то в 7-суточных

ре и состоит, в основном из мигрирую-, щих тяжей и пластов леммоцитов с заключенными в них новообразующимися и регенерирующими отростками нервных- клеток. На периферии трансплантата глиальные клетки образуют монослойную выстилку из полигональных-клеток. На поверхности этой выстилки находятся простирающиеся на большом протяжении тяжи веретенообразных леммоцитов, формируюпдих сложную трехмерную сеть. В тяжах, расположенных ближе к центру, леммоциты располагаются в несколь- как прави- 15 ко пучков, плотно прилегающих друг

к другу, а по мере удаления к периферии тяжи делятся на более тонкие

ветви, выстраиваются в один ряд, об20

25

30

разуя характерные цепочки из веретенообразных клеток, соединяющихся своими отростками. Длина отдельных клеток составляет 20-40 мкм. Наиболее дифференцированные . леммоциты находятся в центральной и промежуточной зонах, а менее дифференцированные на периферии эксплантата и у самой его поверхности. Растущие в тесной связи с леммоцитами аксоны повторяют весь сложный путь образуемых этими клетками сетей и за пределы их не выходят. Аксоны, растущие по цепочкам леммоцитов, заканчиваются, как правило, конусами роста на терминальной одноядерной клетке. На ранних сроках

трансплантатах уже встречаются округ- в тяжах леммоцитов выявляются тонкие

лые нейроны ( мкм) и вытянутые (от 15x40 до 25«55 мкм). О степени дифференцировки нервных клеток свидетельствует не только формирование в их цитоплазме хроматофильного вещества, но и увеличение числа и диаметра образующихся отростков. В восьмусуточных имплантатах обнару- жены нейроны трех уни-, би- и мультиполярные. Наибольший процент составляют мультиполярные нейроны, а .наименьший - псевдоуниполлрные нейро- НЬ1, столь характерные для нормального организма. Нейроны снабжены.хорошо развитыми ветвящимися отростками, которые следуют от центра ганглия к периферии, образуя там гаирокопетлис- тое нервное сплетение. Наиболее плотное сплетение нервных волокон наблюдается в центральной зоне между нейронами.

Зона роста, располагающаяся от центра ганглия к периферии, занимает обшир ную площадь до 4-6 мм в диаметпучки безмякотных аксонов (от 3 до 7). Через 8-12 сут после трансплантации уже встречаются вполне дифференцированные нервные волокна с диа40 метром аксона 1-2 мкм и интернадальным сегментом 100-250 мкм. Такие леммо цнт-аксонные взаимоотношения очень сходны со стадией предмиелйнизации нервного волокна в процессе нормаль45 ного онтогенеза.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в нуклеопоровых диффузионных камерах нейробласты не gQ только сохраняют свою жизнеспособность, но и дифференцируются в зрелые -нейроны с присущими им описанными гистотипическими особенностями.

Дпя сравнения качества выхода gg зрелой нервной ткани в различного типа диффузионных камерах,все те же процедуры были проделаны и на мшшй- опоровых фильтрах. В миллиопоровых диффузионных камерах через 7 сут посветви, выстраиваются в один ряд, об

разуя характерные цепочки из веретенообразных клеток, соединяющихся своими отростками. Длина отдельных клеток составляет 20-40 мкм. Наиболее дифференцированные . леммоциты находятся в центральной и промежуточной зонах, а менее дифференцированные на периферии эксплантата и у самой его поверхности. Растущие в тесной связи с леммоцитами аксоны повторяют весь сложный путь образуемых этими клетками сетей и за пределы их не выходят. Аксоны, растущие по цепочкам леммоцитов, заканчиваются, как правило, конусами роста на терминальной одноядерной клетке. На ранних сроках

пучки безмякотных аксонов (от 3 до 7). Через 8-12 сут после трансплантации уже встречаются вполне дифференцированные нервные волокна с диа40 метром аксона 1-2 мкм и интернадальным сегментом 100-250 мкм. Такие леммо цнт-аксонные взаимоотношения очень сходны со стадией предмиелйнизации нервного волокна в процессе нормаль45 ного онтогенеза.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в нуклеопоровых диффузионных камерах нейробласты не gQ только сохраняют свою жизнеспособность, но и дифференцируются в зрелы -нейроны с присущими им описанными гистотипическими особенностями.

Дпя сравнения качества выхода gg зрелой нервной ткани в различного типа диффузионных камерах,все те же процедуры были проделаны и на мшшй- опоровых фильтрах. В миллиопоровых диффузионных камерах через 7 сут пос51454R386

ле имплантации обнаруживали, как пра- в друга колец из биологически активно-, вило, только погибшие нейроны и гли го материала, торцовые стенки которой альные клетки.выполнены из фильтров, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью полуФормула изобретения чения высокодиффёренцированной нерв- ной ткани из эмбриональных зачатков.

Способ культивирования нервной в качестве фильтров используют нуклео- ткани in vivo в диффузионной камере, поровые, а камеру имплантируют сво состоящей из двух, вставленных друг бодно в брюшную полость животного.

Изобретение относится к биологии и медицине и позволяет в услови- язс in vivo получить высококачественные культуры нервной ткани за срав- - нительно короткий срок с повышенным выходом зрелых нейронов и глиальных клеток. С целью получения высокодифференцированной нервной ткани из эмбриональных зачатков закладки эмбриональных нейральных тканей помещают на нуклеопоровые фильтры, из которых изготовлены диффузионные камеры. Диффузионные камеры после герметиз - ции имплантируются свободно в илео- цекальную область полости крыс-рецепиентов сроком до 20 сут. Предлагаемый способ может быть использован в экспериментальной нейро- биологии для изучения закономерностей гистогенеза и в клинической практике для лечения ряда дистрофических заболеваний, связанных с дефицитом , нейромедиаторных и нейроэндокринных состояний.. § (Л С